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中国黄牛SH2B1基因遗传变异及MYOG基因表达研究

作　者: 杨明娟
导　师: 陈宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 中国黄牛 SH2B1基因 MYOG基因 遗传变异 原核表达
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


SH2B1基因是SH2B家族(SH2-B/SH2B1,APS/SH2B2,LNK/SH2B3)成员之一。作为一种接头蛋白,SH2B1主要通过其SH2结构域与多种细胞因子或生长因子受体结合,从而参与到瘦素、胰岛素等多个信号通路中,参与对食欲、体重、生长、能量平衡、葡萄糖代谢等的调节。MYOG,即肌细胞生成素基因,是生肌调节因子(MRFs)家族的一员,它通过控制成肌细胞的融合和肌纤维的形成来调节肌肉的分化。本研究通过CRS-PCR-RFLP和测序技术对SH2B1基因在5个黄牛群体共1028个个体(郏县红牛297头,草原红牛240头,南阳牛204头,秦川牛183头,鲁西牛104头)中的遗传变异进行检测,并分析其对郏县红牛、南阳牛和秦川牛生长性状的影响,期望找到对中国黄牛生长发育有一定意义的分子标记,以加快现有育种进度;通过Overlap-PCR方法克隆南阳牛MYOG基因编码区序列,构建其原核表达载体并实现目的蛋白的大量表达,为蛋白的纯化及生物学活性检测奠定了基础。本研究的结果如下:1. SH2B1基因遗传变异及其与中国黄牛生长性状的关联分析在SH2B1基因8个基因座共检测到5个SNP:g.796G>A、g.823G>T、g.1537C>A、g.2017A>G、g.4368A>G。其中,g.796G>A和g.823G>T分别导致相应的氨基酸由丙氨酸到酪氨酸、由丙氨酸到丝氨酸的改变,g.4368A>G属于同义突变,g.823G>T、g.1537C>A分别位于内含子1和3。对编码区的3个SNP进行群体遗传学分析、连锁分析、单倍型分析以及与生长性状的关联分析。发现在g.796G>A位点,郏县红牛、南阳牛和鲁西牛处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05),草原红牛和秦川牛处于平衡状态(P>0.05);在g.823G>T位点,5个群体均处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05);在g.4368A>G位点,5个群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。在g.796G>A位点,南阳牛和鲁西牛处于中度多态(0.25<PIC<0.5),其他群体处于低度多态(PIC<0.25);在g.823G>T位点,除草原红牛处于低度多态(PIC<0.25)外,其他群体均处于中度多态(0.25<PIC<0.5);在g.4368A>G位点,5个群体均处于低度多态(PIC<0.25)。连锁不平衡分析显示,g.796G>A与g.823G>T在郏县红牛、南阳牛、秦川牛和鲁西牛中处于强连锁状态(r~2 >0.33)。单倍型分析共揭示了8种单倍型,出现频率最高的前三种是GGA、GTA、ATA,分别占到67.9%、14.5%、12.7%。关联分析结果显示:在郏县红牛中,g.796G>A位点与十字部高显著相关(P<0.05),g.823G>T位点与体高极显著相关(P<0.01)、与十字部高显著相关(P<0.05),表明g.796G>A、g.823G>T可以作为郏县红牛成年期生长性状的分子标记。在南阳牛中,g.796G>A位点与12月龄体高显著相关(P<0.05),g.823G>T位点与12月龄体高、体长、坐骨端宽显著相关(P<0.05),g.4368A>G位点与6月龄坐骨端宽显著相关(P<0.05),说明g.796G>A、g.823G>T、g.4368A>G可以作为南阳牛早期生长发育的分子标记,应用于标记辅助选择。在秦川牛中,g.796G>A和g.823G>T位点与成年体长显著相关(P<0.05),表明二者可以作为秦川牛成年阶段生长性状的分子标记。2. MYOG基因的克隆及其原核表达通过Overlap-PCR方法克隆南阳牛MYOG基因编码区全长,构建其原核表达载体pET28a-MYOG。对表达条件从诱导时间、诱导温度和IPTG浓度三个方面进行优化,将IPTG终浓度为0.01 mmol/L、诱导温度为37℃、诱导6 h作为MYOG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的最佳条件。通过Western blot检测,确定了所表达蛋白正是目的蛋白。这些结果为MYOG基因的功能研究提供了依据。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章 文献综述  13-20
  1.1 SH2B1 基因研究进展  13-16
    1.1.1 SH2B1 结构与分布  13
    1.1.2 SH2B1 作为接头蛋白的作用机制  13-14
    1.1.3 SH2B1 与代谢、生长  14-16
    1.1.4 SH2B1 目前研究概况  16
  1.2 MYOG 基因研究进展  16-18
    1.2.1 MRFs 家族概况  16-17
    1.2.2 MYOG 与肌肉发育  17-18
    1.2.3 MYOG 多态性研究  18
  1.3 研究的目的和意义  18-20
第二章 SH2B1 基因遗传变异研究  20-39
  2.1 材料与方法  20-24
    2.1.1 试验材料  20-21
      2.1.1.1 试验动物  20
      2.1.1.2 试验试剂  20
      2.1.1.3 仪器设备  20-21
      2.1.1.4 主要试剂和溶液的配制  21
    2.1.2 试验方法  21-24
      2.1.2.1 血样的采集  22
      2.1.2.2 牛全血基因组DNA 的提取  22
      2.1.2.3 DNA 质量检测、纯化及稀释  22
      2.1.2.4 PCR 反应所用引物的设计  22
      2.1.2.5 PCR 反应条件优化  22-23
      2.1.2.6 测序  23
      2.1.2.7 PCR 产物的CRS-PCR-RFLP 分析  23-24
    2.1.3 资料的统计与分析  24
  2.2 结果与分析  24-35
    2.2.1 牛基因组DNA 样品的检测  24
    2.2.2 SH2B1 基因多态性检测  24-28
      2.2.2.1 SH2B1 基因各基因座PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测  24-25
      2.2.2.2 SH2B1 基因各基因座混合DNA 扩增后的测序结果  25-26
      2.2.2.3 SH2B1 基因编码区各多态位点的CRS-PCR-RFLP 检测  26-28
      2.2.2.4 SH2B1 基因编码区各多态位点不同基因型的DNA 测序验证  28
    2.2.3 SH2B1 基因编码区各多态位点的群体遗传学分析  28-29
    2.2.4 SH2B1 基因编码区多态位点的连锁不平衡分析  29-30
    2.2.5 SH2B1 基因单倍型分析  30
    2.2.6 SH2B1 基因编码区各多态位点与生长性状的关联分析  30-35
      2.2.6.1 SH2B1 基因编码区各多态位点与郏县红牛生长性状的关联分析  31-32
      2.2.6.2 SH2B1 基因编码区各多态位点与南阳牛生长性状的关联分析  32-34
      2.2.6.3 SH2B1 基因编码区各多态位点与秦川牛生长性状的关联分析  34-35
  2.3 讨论  35-37
    2.3.1 SH2B1 基因在5 个黄牛群体中的遗传多样性  36
    2.3.2 位点间连锁不平衡在不同品种间的差异  36
    2.3.3 SH2B1 基因单倍型在不同品种间的分布差异  36-37
    2.3.4 SH2B1 多态性与黄牛生长性状的相关分析  37
  2.4 小结  37-39
第三章 MYOG 基因的克隆及原核表达研究  39-48
  3.1 材料与方法  39-44
    3.1.1 试验材料  39-41
      3.1.1.1 试验试剂  39
      3.1.1.2 仪器设备  39-40
      3.1.1.3 溶液的配制  40-41
      3.1.1.4 菌株和载体  41
    3.1.2 试验方法  41-44
      3.1.2.1 引物的设计与合成  41-42
      3.1.2.2 Overlap-PCR 方法克隆MYOG 基因CDS 全长  42
      3.1.2.3 目的基因与空载体的双酶切  42
      3.1.2.4 载体与目的基因的连接反应  42
      3.1.2.5 连接产物转化JM109 感受态细胞  42-43
      3.1.2.6 重组质粒的筛选与鉴定  43
      3.1.2.7 阳性重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞  43
      3.1.2.8 目的蛋白诱导表达条件的优化  43
      3.1.2.9 目的蛋白的Western blot 检测  43-44
  3.2 结果与分析  44-47
    3.2.1 Overlap-PCR 扩增MYOG 基因CDS 区  44
    3.2.2 MYOG 基因原核表达载体pET28a-MYOG 的构建  44-45
    3.2.3 目的蛋白的诱导表达  45-46
    3.2.4 目的蛋白的Western blot 检测  46-47
  3.3 讨论  47
    3.3.1 Overlap-PCR 方法克隆目的基因  47
    3.3.2 MYOG 基因在BL21(DE3)宿主菌中的表达  47
  3.4 小结  47-48
第四章 结论与创新点  48-49
  4.1 结论  48
  4.2 创新点  48-49
参考文献  49-54
附录  54-57
致谢  57-58
作者简介  58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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