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SIRT1通过在α/β珠蛋白基因簇远端调控区（MRE/LCR）特异位点的募集改变组蛋白修饰状态调节珠蛋白基因表达

作　者: 宋崴
导　师: 梁植权；刘德培；吕湘
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 组蛋白珠蛋白转录因子特异基因表达过表达端调控区启动子区克隆细胞株染色质结构基因簇
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

真核基因表达是一个复杂而精细的过程,是遗传调控和表观遗传调控综合作用的结果。作为基因表达调控的中心坏节,真核基因的转录调控可以分为三个层次:DNA水平、染色质水平和核水平。染色质水平作为调控真核基因表达的一种独特方式,日益受到人们重视。真核生物染色质的基本单位是核小体,它由146bp DNA和一个核心组蛋白八聚体组成。核心组蛋白的N-端可以发生乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等多种共价修饰。组蛋白修饰可以独自发挥作用,也可以相互组合形成“组蛋白密码”,共同调节基因表达,而组蛋白乙酰化可能在调节染色体结构和功能上起核心作用。组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶具有相反的活性,它们的作用共同维持着核小体组蛋白上赖氨酸乙酰化水平的动态平衡。目前发现至少有三组蛋白具有组蛋白去乙酰化酶活性。Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶不同于Ⅰ类和Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶,它们是酵母Sir2(silent information regulator 2)的同系物,是NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶,从细菌到人类都具有高度保守性。哺乳动物的SIRT1是Sirtuins家族中与Sir2同源性最高的一个成员,在许多生命过程,如细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤修复、重组、长寿和基因沉默中都发挥了重要的作用。最近的研究表明,SIRT1可以与多种的转录因子,如p53,FOXO家族和MyoD相互作用,调节特异基因表达,从而参与凋亡、分化和发育等重要的生命过程。珠蛋白基因簇是研究染色质结构和基因表达关系的经典模型,它分为α-和β-两个基因簇。人α-珠蛋白基因簇只有两组功能基因(ζ,α2-α1),在个体发育过程中只有一个基因开关。人β-珠蛋白基因簇有三组功能基因(ε,~Gγ-~Aγ,δ-β),在个体发育过程中存在两个基因开关。此外,由一系列高敏位点(HSs)组成的主调控区(majorregulatory elements,MRE)和基因座控制区(locus control region,LCR)作为最主要的远端调控元件,分别调控α-和β-两类珠蛋白基因的表达。本实验中,我们首先用SIRT1干扰和SIRT1HY质粒稳定转染K562细胞,筛选后得到稳定的单克隆细胞株。然后分别在SIRT1干扰及过表达SIRT1HY突变体的K562细胞中,用MTT技术检测细胞增殖的变化;联苯胺染色结合半定量RT-PCR分析血红蛋白生成和珠蛋白基因表达的改变。为了进一步阐述SIRT1调节珠蛋白基因表达的分子机制,我们通过ChIP实验检测了SIRT1在α-和β-珠蛋白基因簇上的募集,并通过ChIP实验分别检测了α-珠蛋白基因簇MRE区(HS40、HS33、HS10),ζ-和α2-,α1-珠蛋白基因启动子区,以及β-珠蛋白基因簇LCR区(HS1-5),ε-、γ-和β-珠蛋白基因启动子区的H3乙酰化、H4乙酰化与H3-K4双甲基化修饰的变化。最后,检测了SIRT1对参与调控珠蛋白基因表达的红系相关转录因子表达的影响,并检测SIRT1对GATA-1乙酰化修饰的影响,通过ChIP实验检测SIRT1对GATA-1和NF-E2/P45在β-珠蛋白基因簇上募集情况的影响。结果显示:(1)在K562细胞中干扰SIRT1表达后抑制细胞增殖。(2)在K562细胞中干扰SIRT1表达促进血红蛋白的生成并伴随着珠蛋白基因mRNA的上调,并且在hemin诱导后仍保持这种上调趋势。(3)在K562细胞中过表达SIRT1HY抑制细胞增殖。(4)在K562细胞中过表达SIRT1HY促进血红蛋白的生成并伴随着珠蛋白基因mRNA的上调,并且在hemin诱导后仍保持这种上调趋势。(5)ChIP实验可检测到SIRT1在α-珠蛋白基因簇MRE区HS40和HS10的募集,以及在β-珠蛋白基因簇LCR区HS4和HS2的募集。(6)在K562细胞中抑制SIRT1表达和过表达SIRT1HY后,α珠蛋白基因簇MRE上的高敏位点HS40和HS10的组蛋白H3和H4乙酰化修饰水平明显增加,ζ-、α2-和α1-珠蛋白基因启动子区的H3和H4乙酰化修饰水平没有明显变化;而H3-K4双甲基化修饰水平在MRE区HS40、HS33和HS10,以及ζ-和α2-珠蛋白基因启动子区均有一定的上调,α1-珠蛋白基因启动子区没有明显变化。(7)在K562细胞中抑制SIRT1表达和过表达SIRT1HY后,β-珠蛋白基因簇LCR上的高敏位点HS5、HS4和HS2的组蛋白H3和H4乙酰化修饰水平明显增加,ε-、γ-和β-珠蛋白基因启动子区的H3和H4乙酰化修饰水平也有增加;而H3-K4双甲基化修饰水平在LCR和ε-、γ-和β-珠蛋白基因启动子区均有一定的上调。(8)在K562细胞中抑制SIRT1表达和过表达SIRT1HY,均未在mRNA水平和蛋白水平影响主要的红系相关转录因子的表达、乙酰化修饰和在珠蛋白基因簇上的募集。结果表明:(1)在K562细胞中,SIRT1可以调节珠蛋白基因的表达。(2)SIRT1调节珠蛋白基因的表达是去乙酰化酶活性依赖的。(3)在α-珠蛋白基因簇MRE区的HS40和HS10,以及β-珠蛋白基因簇LCR区的HS4和HS2上均可检测到SIRT1的募集。(4)SIRT1影响α-和β-珠蛋白基因簇的组蛋白修饰水平。(5)SIRT1可能不影响主要的红系相关转录因子的表达、乙酰化修饰以及在珠蛋白基因簇上的募集。综合以上结果,SIRT1可能通过募集到α/β珠蛋白基因簇远端调控区(MRE/LCR)的特定高敏位点,影响组蛋白修饰状态,并最终调节珠蛋白基因表达。

全文目录

目录  3-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-29
  1.组蛋白修饰是真核基因表达调控的重要方式  12-21
    1.1 真核基因表达调控具有层次性  12-13
    1.2 染色质水平的调控是真核基因表达调控的独特方式  13-14
    1.3 组蛋白乙酰化水平的变化具有重要意义——组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶  14-21
      1.3.1 Ⅰ类和Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶的生物学功能  15-17
      1.3.2 SIRT1是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶  17-21
        1.3.2.1 SIRT1可与多种转录因子相互作用  18-20
        1.3.2.2 SIRT1可影响组蛋白修饰水平  20-21
  2.珠蛋白基因簇是研究真核基因表达调控的经典模型  21-27
    2.1 人珠蛋白基因簇结构与表达特点  22-23
    2.2 染色质结构的变化参与β-珠蛋白基因簇激活的全过程  23-27
    2.3 染色质结构变化也参与α-珠蛋白基因簇的调控  27
  3.本研究的理论问题与主要内容  27-29
材料与方法  29-46
  1.实验材料  29-31
    1.1 菌株与质粒  29
    1.2 细胞系  29
    1.3 限制性内切酶及修饰酶  29
    1.4 抗体  29-30
    1.5 其它主要试剂和材料  30
    1.6 主要仪器设备  30-31
  2.实验方法  31-46
    2.1 基本技术路线  31
    2.2 细菌操作与质粒的转化  31-33
      2.2.1 感受态大肠杆菌DH5-α制备  31-32
      2.2.2 质粒的转化  32
      2.2.3 质粒的提取和纯化  32-33
    2.3 细胞培养  33-34
      2.3.1 细胞的生长条件  33
      2.3.2 细胞的传代  33
      2.3.3 细胞的复苏及冻存  33-34
    2.4 K562细胞的红系诱导和检测  34
      2.4.1 K562细胞向红系分化的诱导  34
      2.4.2 K562细胞红系分化的检测  34
    2.5 细胞的转染和单克隆株筛选  34-35
    2.6 MTT分析细胞增殖情况  35
    2.7 半定量RT-PCR  35-37
      2.7.1 细胞总RNA的提取  35
      2.7.2 cDNA第一链的合成  35-36
      2.7.3 RT-PCR检测  36-37
    2.8 Western-Blotting  37-40
      2.8.1 细胞总蛋白提取  37
      2.8.2 蛋白质浓度测定  37
      2.8.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  37-38
        2.8.3.1 胶的制备  37-38
        2.8.3.2 样品的制备和上样  38
        2.8.3.3 电泳  38
      2.8.4 转膜  38
      2.8.5 抗原抗体反应  38-39
      2.8.6 辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白  39-40
    2.9 染色质免疫沉淀(ChIP)  40-44
      2.9.1 细胞培养  40
      2.9.2 细胞固定  40
      2.9.3 细胞核的提取  40
      2.9.4 细胞核的裂解与超声处理  40-41
      2.9.5 超声结果的分析  41
      2.9.6 免疫沉淀  41
      2.9.7 DNA的分离及纯化  41-42
      2.9.8 半定量PCR反应  42-44
    2.10 蛋白质免疫共沉淀  44-46
      2.10.1 细胞培养  44
      2.10.2 细胞裂解  44-45
      2.10.3 免疫沉淀  45
      2.10.4 SDS-PAGE  45-46
实验结果  46-71
  1.抑制SIRT1表达对K562细胞增殖及珠蛋白基因表达的影响分析  46-52
    1.1 K562细胞中SIRT1干扰的稳定单克隆细胞株的筛选  46
    1.2 稳定中克隆细胞株SIRT1干扰效率的鉴定  46-47
      1.2.1 RT-PCR检测SIRT1的干扰效率  46-47
      1.2.2 Westen Blot检测SIRT1的干扰效率  47
    1.3 干扰SIRT1表达抑制K562细胞的增殖  47-48
    1.4 K562细胞中抑制SIRT1表达促进血红蛋白的生成  48-49
    1.5 K562细胞中抑制SIRT1表达促进珠蛋白基因的表达  49-52
  2.过表达SIRT1HY对K562细胞增殖及珠蛋白基因表达的影响分析  52-57
    2.1 过表达SIRT1 HY稳定转染单克隆细胞株的筛选  52
    2.2 过表达SIRT1 HY稳定转染单克隆细胞株的鉴定  52-53
      2.2.1 RT-PCR鉴定过表达SIRT1HY稳定转染单克隆细胞株  52-53
      2.2.2 Westen Blot鉴定过表达SIRT1HY稳定转染单克隆细胞株  53
    2.3 过表达SIRT1HY抑制K562细胞的增殖  53-54
    2.4 K562细胞中过表达SIRT1HY促进血红蛋白的生成  54-55
    2.5 K562细胞中过表达SIRT1HY促进珠蛋白基因的表达  55-57
  3.SIRT1调节珠蛋白基因表达的分子机制  57-71
    3.1 SIRT1住珠蛋白基因簇上的募集  57-60
      3.1.1 ChIP分析条件的建立  58-59
      3.1.2 SIRT1在α-珠蛋白基因簇上的募集  59-60
      3.1.3 SIRT1在β-珠蛋白基因簇上的募集  60
    3.2 SIRT1调节珠蛋白基因簇的组蛋白修饰状态  60-66
      3.2.1 SIRT1调节α-珠蛋广1基因簇的组蛋白修饰状态  61-63
      3.2.2 SIRT1调节β-珠蛋广1基因簇的组蛋白修饰状态  63-66
    3.3 SIRT1与红系相关的转录因子  66-71
      3.3.1 SIRT1与红系相关转录因子的表达  66-68
        3.3.1.1 SIRT1与红系相关转录因子的表达(mRNA水平)  66-68
        3.3.1.2 SIRT1与红系相关转录因子的表达(蛋白水平)  68
      3.3.2 SIRT1与红系相关转录因子的乙酰化修饰水平(GATA-1)  68-69
      3.3.3 SIRT1与红系相关转录因子在B-珠蛋白基因簇上的募集(GATA-1、NF-E2/P45)  69-71
讨论  71-82
  1.SIRT1以去乙酰化酶活性依赖的方式调节珠蛋白基因的表达  71-73
    1.1 SIRT1可以调节珠蛋白基因的表达  71-72
    1.2 SIRT1对珠蛋白基因表达的调节是去乙酰化酶活性依赖的  72-73
  2.SIRT1通过调节珠蛋白基因簇上调控区的组蛋白修饰状态来调控珠蛋白基因表达  73-77
    2.1 SIRT1在α/β珠蛋白基因簇远端调控区(LCR/MRE)特定高敏位点募集并调节乙酰化修饰水平  73-75
    2.2 SIRT1调控珠蛋白基因表达的复杂性  75-77
  3.未检测到参与SIRT1调控珠蛋白基因表达的转录因子  77-78
  4.SIRT1可能调节红系分化  78-80
  5.本研究不足之处和今后的工作设想  80-81
  小结  81-82
参考文献  82-90
文献综述  90-113
英文名词及缩写  113-115
致谢  115-116
个人简历  116-118

SIRT1通过在α/β珠蛋白基因簇远端调控区（MRE/LCR）特异位点的募集改变组蛋白修饰状态调节珠蛋白基因表达

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