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苏云金素合成基因簇的初步定位及苏云金素与杀虫晶体蛋白的协同作用

作　者: 董纯明
导　师: 喻子牛
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌苏云金素基因簇突变株杀虫晶体蛋白协同作用
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

苏云金素（thuringiensin）是由苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）某些菌株产生的一种热稳定的外毒素，它是一种核苷类似物，分子量701，它的作用机制是通过和ATP竞争酶的结合位点，从而抑制DNA依赖性RNA聚合酶的活性，所以具有广谱的杀虫活性。并且，苏云金素的毒性远低于大多数化学农药的毒性，所以它具有被开发成为广谱杀虫剂的潜力。本文第一部分，为了研究苏云金芽胞杆菌内生质粒对苏云金素产量的影响，以苏云金素高产菌株CT-43及其突变株CT-43-1c，CT-43-5，CT-43-7，CT-43-55，CT-43-62为材料，系统分析了他们的质粒图谱和杀虫晶体蛋白组成，同时通过高效液相色谱（HPLC）分析了他们苏云金素的产量；并对菌株CT-43高产苏云金素的突变株CT-43-1c进行了质粒消除，构建了一株苏云金素缺失突变株F-15，通过脉冲电泳（PFGE）分析了突变株F-15与菌株CT-43及CT-43-1c质粒图谱之间的差异，并利用高效液相色谱分析了三者苏云金素的产量；同时对突变株F-15的生物学特定进行了研究。结果表明，在菌株CT-43及其突变株中，凡是具有cry1B基因（编码140kDa的杀虫晶体蛋白）的菌株CT-43，CT-43-1c，CT-43-7，都高产苏云金素：而不具有cry1B基因的菌株CT-43-5，CT-43-55，CT-43-62的苏云金素产量约为高产菌株的1／50。同时，分析脉冲图谱发现突变株F-15与CT-43和CT-43-1c相比，分别丢失了3个和2个质粒；PCR、SDS-PAGE和HPLC结果显示，突变株F-15由于缺失了由cry1B基因编码的140kDa的杀虫晶体蛋白，而成为不产苏云金素的无晶体突变株；同时三者质粒图谱之间的差异也暗示了，苏云金素的产生和cry1B基因所在的质粒直接相关，这为苏云金素基因簇的克隆提供了理论依据并提供了良好的克隆受体。本文的第二部分，以棉铃虫（H.armigera）和甜菜夜蛾（S.exigua）为靶标，用饲料染毒法，测定了苏云金素和四种纯化后的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crysta Proteins，ICPs）之间的协同增效作用。结果表明，当以棉铃虫为靶标时，cry1Aa，cry1Ac，cry1B和cry1C与苏云金素分别按质量比14.1：1；1.2：1；27.0：1：6.8：1混合时协同增效作用最强，分别增效66％，58％，85％和76％，同时，cry1Aa和cry1Ac与苏云金素混用后的LT₅₀比对应的杀虫蛋白单剂的LT₅₀分别缩短12.81小时和9.16小时；以甜菜夜蛾为靶标时，cry1Aa，cry1Ac，cry1B和cry1C与苏云金素分别按质量比246.2：1；15.3：1；246.2：1；6.1：1混合时协同增效作用最强，分别增效281％，47％，147％和26％，而cry1C与苏云金素混用后的LT-（50）比cry1C的LT-（50）缩短11.52小时。这为苏云金素与杀虫晶体蛋白复配后，提高杀虫效果和加速害虫死亡提供了依据。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
1 前言  9-21
  1.1 苏云金素  9-21
    1.1.1 苏云金芽胞杆菌的简介  9
    1.1.2 苏云金素的产生及分布  9-10
    1.1.3 苏云金素的分离纯化和检测  10-11
    1.1.4 苏云金素的活性及其作用机理  11-13
    1.1.5 苏云金素的产生和苏云金芽胞杆菌内生质粒的关系  13-16
    1.1.6 苏云金素合成基因簇的研究进展  16-19
    1.1.7 苏云金素的安全性和毒性评价  19-21
    1.1.8 苏云金素的应用前景  21
2 研究目的  21-22
3 材料和方法  22-27
  3.1 实验材料  22-23
    3.1.1 菌株  22
    3.1.2 培养基及培养条件  22-23
    3.1.3 引物以及寡聚脱氧核糖核酸  23
  3.2 试剂与仪器  23-24
    3.2.1 试剂  23
    3.2.2 仪器  23-24
  3.3 实验方法  24-27
    3.3.1 苏云金芽胞杆菌质粒的提取  24
    3.3.2 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提  24
    3.3.3 DNA电泳分析  24-26
    3.3.4 PCR扩增  26
    3.3.5 苏云金芽胞杆菌的质粒消除  26
    3.3.6 杀虫晶体蛋白样品的制备  26
    3.3.7 SDS-PAGE凝胶的制备  26-27
    3.3.8 电泳、染色及脱色  27
    3.3.9 苏云金素的纯化  27
    3.3.10 苏云金素的高效液相色谱检测  27
4 结果与分析  27-36
  4.1 CT-43及其突变株的苏云金素产量和cryl B基因的关系  27-30
    4.1.1 CT-43及其突变株的质粒图谱和杀虫晶体蛋白组成  27-29
    4.1.2 CT-43及其突变株苏云金素产量的检测  29-30
  4.2 苏云金素缺失突变株的筛选及其生物学特性的初步研究  30-36
    4.2.1 苏云金素缺失突变株F-15的筛选  30-31
    4.2.2 苏云金素缺失突变株F-15的生物学特性  31-36
5 小结与讨论  36-39
  5.1 小结  36
  5.2 讨论  36-39
    5.2.1 苏云金素合成基因簇的定位  36-37
    5.2.2 苏云金芽胞杆菌大质粒的分离  37-39
第二章苏云金素与杀虫晶体蛋白的协同作用  39-54
  1 前言  39-43
    1.1 苏云金芽胞杆菌产生的活性物质  39
    1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其基因  39-40
    1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的杀虫机制  40-41
    1.4 苏云金芽胞杆菌不同活性成份之间的协同作用  41-42
    1.5 苏云金芽胞杆菌的协同作用的应用  42-43
  2 研究目的  43
  3 材料和方法  43-47
    3.1 实验材料  43-44
      3.1.1 供试菌株  43
      3.1.2 培养基及培养条件  43-44
      3.1.3 供试昆虫  44
      3.1.4 生物测定试剂和感染饲料配方  44
      3.1.5 其它试剂  44
      3.1.6 实验仪器  44
    3.2 实验方法  44-47
      3.2.1 伴胞晶体的培养  44
      3.2.2 杀虫晶体蛋白的提纯和定量  44-45
      3.2.3 苏云金素的制备和定量  45
      3.2.4 生物测定  45-46
      3.2.5 苏云金素和杀虫晶体蛋白优化配比的确定  46-47
      3.2.6 协同作用评价  47
      3.2.7 优化配比的 LT_(50)与单一杀虫晶体蛋白LT_(50)的比较  47
  4 结果与分析  47-51
    4.1 杀虫晶体蛋白和苏云金素对靶标的毒力  47-48
    4.2 杀虫晶体蛋白与苏云金素的优化配比  48-50
    4.3 苏云金素与杀虫晶体蛋白的协同作用  50
    4.4 杀虫晶体蛋白与苏云金素复配制剂对靶标致死速度的影响  50-51
  5 小结与讨论  51-54
    5.1 小结  51
    5.2 讨论  51-54
      5.2.1 苏云金素制剂的安全性  51-52
      5.2.2 苏云金素对靶标IC_(50)的判定标准  52
      5.2.3 纯化后杀虫晶体蛋白对混剂毒力的影响  52
      5.2.4 苏云金素和杀虫晶体蛋白复配比例的确定  52-53
      5.2.5 苏云金素对杀虫晶体蛋白增效机理的初步探讨  53-54
参考文献  54-60
致谢  60

苏云金素合成基因簇的初步定位及苏云金素与杀虫晶体蛋白的协同作用

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