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基因转录、DNA复制及染色质结构在基因定点修复中的作用及机制研究
作 者: 尚曦莹
导 师: 梁植权;刘德培;吴雪松
学 校: 中国协和医科大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 修复效率 染色质结构 丁酸钠 医科大学 寡核苷酸 修复过程 偏向性 靶基因 协和 博士学位论文
分类号: Q343
类 型: 博士论文
年 份: 2006年
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内容摘要
基因治疗是目前治愈人类疾病的最根本方法,但因载体安全性差等问题,其临床应用受到了严重限制。要解决这些问题,首先就是要提高治疗的靶向性,其中最彻底的方法就是原位修复有缺陷的基因,即基因定点修复,它在靶向性、安全性及操作的方便性方面与基因治疗其它方法相比有明显的优势。目前最有希望的定点修复载体是单链寡核苷酸(single stranded oligonucleotide,SSO)。以往的工作证实,SSO确有在多系统多层次上完成基因定点修复的能力。但它的主要缺点是修复效率较低,限制了进一步的应用研究。要想提高其修复效率,当务之急就是揭示SSO介导的基因定点修复的作用机制。本组已经构建了哺乳动物细胞定点修复的荧光报告系统(F5细胞),并已筛选出了最佳打靶分子(E6)及最佳转染试剂。当把Thymidine作用于F5细胞后,发现修复效率显著提高,因此提出了复制叉渗漏,SSO掺入假说。转录与复制是两个密切联系的过程,尽管转录相关机制研究已取得一定进展,但这些工作都是通过在全基因组范围内调节转录活性而完成的。在这种全局性的调控方式下,最终修复效率的变化是由多种因素改变引起的,不利于进行机制探讨。因此本实验中我们采用了一种特异性的调节靶基因转录的策略,即以靶基因为模板,合成序列特异性的辅助寡核苷酸。因每一条辅助寡核苷酸都可与靶基因上某段特定区域的DNA双链中的一条链互补配对,进而在这个特定的区域内形成一个loop结构。Loop结构形成后,必然会影响到靶基因的转录及复制过程,进而导致修复效率的改变。我们选择了100nt长和25nt长两种长度的辅助寡核苷酸分别与E6一起进行修复实验,发现两组实验的修复效率都有提高。然后,我们把两段25nt长的辅助寡核苷酸作为一个组合,并采用两步转染法进行修复实验,效率提高至对照组的5倍。我们还比较了互补的辅助寡核苷酸的修复效率,结果显示两组的修复效率基本持平。上述实验结果均支持我们设计辅助寡核苷酸的初步设想,即通过形成loop结构,调解靶基因的转录及复制过程,进而改变修复效率。把thymidine和辅助寡核苷酸共同作用于F5细胞后,结果提示最终的修复效率和只用thymidine时的效率基本持平,以这个结果为基础,我们提出了转录复制偶联的修复机制。丁酸钠作用于F5细胞,修复效率比对照组提高了3倍。当把丁酸钠与辅助寡核苷酸共同作用于F5细胞中,结果显示修复效率比只用辅助寡核苷酸的实验组低。针对此结果,我们认为丁酸钠即可开放染色质结构,又可加快转录速度的特点对定点修复过程既有利又有弊。本实验中,定点修复过程依旧表现出明显的链偏向性,无论在辅助寡核苷酸或丁酸钠的作用下,总是针对非转录链打靶的分子起效,而与之互补的另一条打靶分子几乎没有修复作用。我们认为此链的偏向性的形成涉及了复制、转录等多种因素的共同作用。
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全文目录
摘要 6-8 Abstract 8-10 前言 10-27 1.基因定点修复概述 11-12 1.1 基因定点修复基本原理 11-12 1.2 基因定点修复具有靶向性、安全性及操作的方便性 12 2.基因定点修复研究进展 12-25 2.1 RDO介导的嵌合体修复术 12-15 2.2 SSO介导的基因定点修复 15-17 2.2.1 从RDO分子到SSO分子 15 2.2.2 SSO分子特点 15-17 2.2.3 SSO作为修复载体的优越性 17 2.3 SSO介导的基因定点修复的基本分子过程 17-19 2.3.1 DNA配对是修复反应的限速步骤 17-18 2.3.2 若干修复通路及功能蛋白共同参与 18-19 2.4 SSO定点修复的分子机制 19-25 2.4.1 复制在修复过程中起重要作用 19-24 2.4.2 转录与基因定点修复密切相关 24-25 3.本实验设计概述 25-27 材料 27-29 1.菌株和质粒 27 2.细胞系 27 3.转染试剂 27 4.寡核苷酸 27-28 5.药物 28 6.其它主要试剂及试剂盒 28 7.主要仪器设备 28-29 方法 29-39 1.细胞培养 30-33 1.1 G418溶液配制 30 1.2 细胞生长条件 30-31 1.3 细胞传代 31 1.4 复苏及冻存 31-32 1.4.1 复苏方法 31 1.4.2 冻存方法 31-32 1.5 台盼兰计数活细胞 32 1.6 细胞记数法 32-33 2.Thymidine及丁酸钠溶液的配制 33 3.Lipofectamine 2000法转染DNA 33-34 4.设计辅助寡核苷酸 34-35 5.辅助寡核苷酸介导的基因定点修复 35-37 5.1 一步转染法 35 5.2 两步转染法 35-36 5.3 thymidine或丁酸钠作用下的两步转染法 36-37 6.Thymidine及丁酸钠作用下的基因定点修复 37-38 7.荧光显微镜下观察基因定点修复的发光细胞 38 8.FACS定量分析发光细胞比例 38-39 实验结果 39-53 1.通过辅助寡核苷酸调节基因转录提高定点修复效率 39-47 1.1 实验一、100nt长辅助寡核苷酸 39-40 1.2 实验二、25nt长辅助寡核苷酸 40-42 1.3 实验三、两段25nt长辅助寡核苷酸共同参与基因定点修复 42-45 1.4 实验四、与非转录链配对的辅助寡核苷酸参与的基因定点修复实验 45-46 1.5 不同长度辅助寡核苷酸作用下修复效率的比较 46-47 2.利用丁酸钠活化细胞染色质结构提高定点修复效率 47 3.DNA复制、基因转录及染色质结构对于定点修复的综合作用研究 47-50 3.1 丁酸钠与辅助寡核苷酸共同作用的定点修复 47-49 3.2 thymidine与辅助寡核苷酸共同作用的定点修复 49-50 4.SSO分子的链偏向性分析 50-53 4.1 辅助寡核苷酸作用下,链的偏向性分析 50-51 4.2 丁酸钠作用下,链的偏向性分析 51-53 讨论 53-68 1.靶基因特异性转录调节促进定点修复反应 53-61 1.1 特异性转录调节对于寡核苷酸修复的必要性 53 1.2 以R-LOOP原理设计辅助寡核苷酸调节基因转录 53-57 1.3 短片段辅助寡核苷酸可以提高定点修复效率 57-60 1.4 辅助寡核苷酸参与基因定点修复实验的总结 60-61 2.基因定点修复的复制转录动态偶联 61-62 3.染色质结构变化影响定点修复过程 62-64 3.1 染色质结构的周期性变化 62-63 3.2 采用丁酸钠处理细胞可提高修复效率 63-64 3.3 丁酸钠抵销了辅助寡核苷酸的部分作用 64 4.基因定点修复中SSO作用呈链的偏向性 64-66 4.1 转录相关的链的偏向性 64-65 4.2 复制相关的链的偏向性 65-66 5.SSO介导的基因定点修复是一个复杂的分子过程 66-67 6.本实验的优势及创新性 67 7.本实验的不足及进一步的设想 67-68 小结 68-69 参考文献 69-72 文献综述 72-89 Reference 84-89 英文名词及缩写 89-90 致谢 90-91 个人简历 91-93
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中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 细胞遗传学
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