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多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）SC2 fus基因簇的克隆与分析

作　者: 赵丽明
导　师: 杜秉海
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 多粘类芽孢杆菌 PGPR NRPSs fus基因簇 fusaricidin合成酶基因
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SC2是一株从辣椒根际分离筛选的根际促生细菌,该菌株抗菌谱广,对辣椒根腐病原菌( Fusarium solani)、黄瓜枯萎病原菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)、黄瓜霜霉病原菌(Pseudoperonospora cubensis)、芹菜灰霉病原菌(Botrytis cinerea Pers)以及西红柿灰霉病原菌(Botrytis cinerea)等具有良好的拮抗效果。用已报道的检测非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)基因保守区的兼并引物TGD和LGG为引物,以多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa )SC2的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得一段长度为497bp的NRPS基因保守区序列。采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法,以SC2菌株基因组DNA为模板,根据NRPS基因保守区序列,分别向两侧设计特异性引物,扩增该已知序列的两侧序列。随后,通过多次特异性引物设计,进行TAIL-PCR。同时,根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bamC、mycC、ituC和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42 bmyC的同源序列,设计兼并引物进行PCR扩增,将得到的所有序列拼接,得到长度为19844bp的DNA序列。经BLAST比对发现,此DNA序列与P. polymyxa PKB1中fus基因簇具有很高的相似性,因此,根据P. polymyxa PKB1中fusA基因簇与本试验获得的DNA序列的同源区域设计一系列兼并引物,进行特异性扩增,最终得到一条32680bp的DNA序列。将得到的总长为32680bp的DNA序列提交GenBank,获得序列号为EU431181,该序列包含8个ORF,即fus基因簇,这8个ORF分别为fusG,fusF,fusE,fusD,fusC,fusB,fusA,fusTE,其核苷酸序列与多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa) PKB1中对应的fusG,fusF,fusE,fusD,fusC,fusB,fusA,fusTE的相似性分别为90.61%,93.42%,91.75%,85.54%,83.29%,89.95%,88.97%,82.88%;其衍生氨基酸序列与多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)PKB1中对应的FusG,FusF,FusE,FusD,FusC,FusB,FusA,FusTE的相似性分别98.77%,99.15%,98.28%,90.64%,96.31%,97.78%,96.81%,和76.35%。另外,通过NCBI-BLAST,对fus基因簇的每个ORF进行了初步的功能分析。fusA为一个完整的23727bp的ORF,编码7908个氨基酸,对其多肽序列进行结构域分析,结果表明,该多肽序列包含六个模块,分别为C-A-T、C-A-T-E、C-A-T、C-A-T-E、C-A-T-E和C-A-T;六个模块中的前五个模块的A结构域的特异性底物分别为L-Thr,D-Val,L-Tyr,D-Thr和D-Asn,但是第六个模块中特异性底物尚不能完全确定,通过构建系统发育树可以推测得到,多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)SC2的FusA-A6的结构域的特异性底物为D-Ala。预测的氨基酸残基组成、顺序与多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa )KT-8产生的fusaricidin C和多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa )L-1129产生的LI-F03a的第1、2、3、4、5、6位上氨基酸残基组成和顺序完全一致,因此,可以初步判断P. polymyxa SC2可能产生具有抗真菌活性的fusaricidin C。多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)SC2的FusA的六个A结构域的氨基酸序列与多粘类芽孢杆菌(P. poly- myxa)PKB1的FusA的A1、A2、A3、A4、A5和? A6结构域的相似性分别为94.13%、94.82%、91.52%、94.55%、95.34%和96.73%;其对应的核苷酸序列同源性分别为86.95%、89.00%、82.18%、89.38%、87.31%和89.49%。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-12
1 引言  12-50
  1.1 植物根际促生细菌  12-13
  1.2 生防细菌抗菌机制  13-24
    1.2.1 产生铁载体  13-14
    1.2.2 拮抗作用  14-21
    1.2.3 植物诱导抗性  21-22
    1.2.4 空间营养竞争作用  22-23
    1.2.5 重寄生作用  23-24
  1.3 微生物防治的优点  24
  1.4 微生物防治中生防细菌的应用  24-26
  1.5 非核糖体肽类生物合成机制  26-35
    1.5.1 非核糖体肽合成酶的结构  26-27
    1.5.2 非核糖体肽的一般合成过程  27-29
    1.5.3 芽孢杆菌脂肽抗生素合成过程  29-34
    1.5.4 芽抱杆菌非核糖体肽的应用前景  34-35
  1.6 具有生防作用的多粘类芽孢杆菌  35-47
    1.6.1 产生的抗菌物质  36-44
    1.6.2 Fusaricidin 合成分子机制  44-47
  1.7 本研究的目的意义  47-48
  1.8 研究内容、技术路线及方法  48-50
    1.8.1 研究内容  48
    1.8.2 技术路线  48
    1.8.3 研究方法  48-50
2 材料与方法  50-61
  2.1 菌株与质粒  50
  2.2 培养基及试剂  50-51
    2.2.1 培养基  50
    2.2.2 DNA 提取试剂  50
    2.2.3 PCR 试剂  50-51
    2.2.4 感受态细胞制备试剂（CaC1_2 法）  51
    2.2.5 琼脂糖凝胶电泳试剂  51
  2.3 主要仪器设备  51-52
  2.4 基因组DNA 的提取  52-53
  2.5 琼脂糖凝胶电泳  53
  2.6 DNA 浓度的确定  53
  2.7 NRPS 基因保守区PCR 扩增  53-54
  2.8 NRPS 基因保守区域侧翼序列的克隆  54-56
    2.8.1 TAIL-PCR 引物的设计  54-55
    2.8.2 TAIL-PCR 反应体系  55-56
    2.8.3 TAIL-PCR 反应条件  56
  2.9 fus 基因簇的克隆  56-57
  2.10 PCR 产物凝胶回收  57-58
  2.11 DH5α感受态细胞制备(CaCl_2法)  58
  2.12 PCR 产物克隆  58-59
  2.13 重组质粒的筛选与鉴定  59
    2.13.1 IPTG-X-gal 筛选  59
    2.13.2 菌落的快速裂解及质粒大小的检查  59
  2.14 序列测定  59-60
  2.15 DNA 序列分析  60
  2.16 结构域预测  60
  2.17 FusA-A6 氨基酸残基成分分析  60-61
3 结果与分析  61-70
  3.1 多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）SC2 的NRPS 基因保守区域克隆  61
  3.2 NRPS 基因保守区侧翼序列的克隆  61-63
  3.3 fus 基因簇的克隆  63
  3.4 fus 基因簇序列分析  63-64
  3.5 fus 基因簇组织示意图  64-65
  3.6 fusA 结构域预测  65-67
  3.7 FusA-A6 氨基酸残基成分分析  67
  3.8 讨论  67-70
4 结论  70-71
  4.1 结论  70
  4.2 尚待完成的工作  70-71
参考文献  71-87
致谢  87-88
攻读学位期间发表论文情况  88

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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