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草鱼TLR7基因的克隆与病毒感染条件下的表达研究

作　者: 张荣芳
导　师: 苏建国
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 水生生物学
关键词: 草鱼内参基因 TLR7 基因克隆 mRNA表达
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水经济鱼类之一,也是我国养殖产量最高的鱼类之一,然而由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病是危害草鱼最为严重的病毒性疾病,给水产养殖业造成了重大的经济损失,因此,对于草鱼抗病基因的研究显得尤为的重要。在应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究基因的表达过程中,确定一种或两种理想的或合适的内参基因可以提高结果的准确性和可靠性。本研究以草鱼为研究对象,评价了β-actin、18S rRNA、GAPDH、EF1α四种内参基因在草鱼肾细胞感染病毒条件下和poly(I:C)刺激条件下的稳定性,并克隆了草鱼TLR7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因,确定了其在体内和体外病毒感染条件下的表达模式。1.内参基因在草鱼肾细胞中的稳定性评价在GCRV感染条件下和poly(I:C)刺激条件下收集细胞样品,通过qRT-PCR技术确定四种内参基因在不同处理条件下的表达,并结合Ct值通过3种内参筛选分析软件(BestKeeper,geNorm,NormFinder)对四种内参基因做出稳定性评价。在GCRV感染条件下,四种内参基因在草鱼肾细胞中的表达稳定性依次为EF1α>GAPDH>β-actin>18S rRNA;在poly(I:C)刺激条件下,四种内参基因在肾细胞中的表达稳定性依次为EF1α>β-actin>18S rRNA>GAPDH。EF1α在GCRV或poly(I:C)刺激条件下的表达稳定性均是最高的,因此,在相同或类似基因表达研究中,EF1α可以作为合适的内参基因来研究目的基因的表达模式。2.草鱼TLR7基因的克隆与表达Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)在病毒单链RNA的识别及感染的信号传导中起重要作用,本研究通过同源克隆方法和RACE技术应用PCR反应获得草鱼TLR7 cDNA序列,通过体内不同组织和体外肾细胞中的病毒感染实验探究了在GCRV感染条件下草鱼TLR7 mRNA的组织表达差异和时序表达模式,并研究了病毒类似物poly(I:C)刺激下TLR7在草鱼肾细胞中的时序表达模式。草鱼TLR7 cDNA全长为3354 bp,编码区3156 bp编码1051个氨基酸,其gDNA全长为4294 bp,含有一个940 bp的内含子。在草鱼鳃、头肾、心脏、肠、肝脏、肌肉、皮肤、脾脏和中肾9个不同组织中,TLR7在感染前的皮肤和脾脏组织中表达量最高,在感染后的大部分组织中,其表达水平均上调,皮肤和头肾中的表达无明显差异,心脏中表达略有下调;不同组织中的时序表达研究结果显示,在肝脏中,草鱼TLR7在病毒感染24h时表达量开始上调,但与对照组无显著性差异,48h时与对照组有显著性差异,72h时回复到正常水平;在脾脏组织中,12h时,TLR7表达上调,且与对照组有显著性差异,24h时虽然上调但与对照组无显著性差异,之后回到正常水平。在poly(I:C)不同处理条件下的草鱼肾细胞中,TLR7的表达均有显著性的提高,但在GCRV感染条件下的肾细胞中TLR7表达在2h、8h和24h时均有下调且与对照组有显著性差异。综上,β-actin、18S rRNA、GAPDH、EF1α四种内参基因在草鱼肾细胞GCRV感染条件下和poly(I:C)刺激条件下表达稳定性最高的内参是EF1α基因,草鱼TLR7对于双链RNA的侵染有应答,这为草鱼的抗病免疫应答机理提供了新思路。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-27
  1.1 草鱼出血病  11-12
  1.2 鱼类免疫系统概述  12-15
    1.2.1 先天性免疫与获得性免疫  12
    1.2.2 鱼类免疫系统  12-15
  1.3 先天免疫系统中的模式识别受体及抗病毒效应分子  15-25
    1.3.1 模式识别受体家族（PRRs）  16-24
    1.3.2 抗病毒效应分子  24-25
  1.4 内参基因的选择  25
  1.5 研究目的及意义  25-27
第二章四种内参基因在草鱼肾细胞中的稳定性研究  27-37
  2.1 前言  27
  2.2 材料与方法  27-30
    2.2.1 材料  27
    2.2.2 主要试剂  27-28
    2.2.3 主要仪器  28
    2.2.4 扩增引物  28
    2.2.5 病毒感染条件下CIK 细胞中各内参的表达  28-30
    2.2.6 poly(I:C)刺激条件下CIK 细胞中各内参的表达  30
  2.3 结果与分析  30-34
    2.3.1 四种内参基因在不同处理条件下的CIK 细胞中的表达  30-32
    2.3.2 病毒感染条件下CIK 细胞中内参的稳定性分析  32-33
    2.3.3 poly(I:C)刺激条件下CIK 细胞中内参的稳定性分析  33-34
  2.4 讨论  34-37
    2.4.1 三种内参分析软件比较  34
    2.4.2 四种内参基因在病毒感染条件下的稳定性  34-35
    2.4.3 四种内参基因在poly(I:C)刺激条件下的稳定性  35-37
第三章草鱼TLR7 基因的克隆与病毒感染条件下的表达研究  37-55
  3.1 前言  37
  3.2 材料与方法  37-45
    3.2.1 材料  37
    3.2.2 主要试剂  37
    3.2.3 主要仪器  37
    3.2.4 感受态细胞的制备  37-38
    3.2.5 CiTLR7 cDNA 中间片段的克隆  38-40
    3.2.6 CiTLR7 cDNA 末端片段的克隆  40-42
    3.2.7 CiTLR7 序列生物信息学分析  42
    3.2.8 CiTLR7 gDNA 结构确定  42-43
    3.2.9 组织表达  43-44
    3.2.10 病毒感染条件下CiTLR7 在CIK 细胞中不同时间的表达  44-45
    3.2.11 poly(I:C)刺激条件下CiTLR7 在CIK 细胞中不同时间的表达  45
  3.3 结果与分析  45-52
    3.3.1 序列分析  45-48
    3.3.2 基因结构  48-50
    3.3.3 组织差异表达  50
    3.3.4 病毒感染条件下CiTLR7 在肝脏、脾脏中的时序表达  50-51
    3.3.5 病毒感染条件下CiTLR7 在CIK 细胞中的时序表达  51-52
    3.3.6 poly(I:C)刺激条件下CiTLR7 在CIK 细胞中的时序表达  52
  3.4 讨论  52-55
第四章结论  55-56
  4.1 四种内参基因在草鱼肾细胞中的稳定性评价  55
  4.2 CiTLR7 的克隆与表达  55-56
参考文献  56-65
致谢  65-66
作者简介  66

草鱼TLR7基因的克隆与病毒感染条件下的表达研究

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