学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

中华鳖肾组织的比较细胞学研究及其ACE2的分布与基因克隆

作　者: 徐春生
导　师: 陈秋生
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 中华鳖肾脏微细结构细胞化学 ACE2 基因克隆双峰驼
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 39次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

肾脏是脊椎动物最主要的排泄器官,生命活动中产生的代谢废物和多余的水分,以尿液的形式通过肾脏排出,对调节机体的水盐代谢和离子平衡具有重要作用。另一方面,肾脏还具有产生多种激素和生物活性物质的功能。因此,其机能的正常与否直接关系到动物的健康。爬行动物处于动物进化过程中的特殊地位,其肾脏是后肾的开端,属于脊椎动物肾脏发育的第五种类型。中华鳖(Pelodiseus sinensis)生活在潮湿的近水源处,机体对水的需求较高,其肾脏在机体保水上发挥重要作用。为了阐明中华鳖肾组织的细胞学特征,选择具有明显耐旱性的双峰驼(Camelus bactrianus)进行比较研究。与中华鳖栖息地环境截然相反,双峰驼生活在干旱的荒漠地区,长期缺水的情况下,仍然能够生存,这与其肾脏的保水功能有关。肾脏通过减少尿液排泄量达到保水的目的,而如何减少尿液量就显得尤为重要。本研究首先从中华鳖肾脏泌尿小管的分布规律及细胞微细结构入手,深入了解肾脏形态与其功能的联系,进一步应用细胞化学反应,探究了四种酶和两种活性物质在中华鳖肾组织中的分布规律,在光镜和电镜下分析了肾组织微细结构的性别差异。在此基础上,阐明了血管紧张素转换酶2(ACE2)在中华鳖肾脏的分布特点,首次克隆并鉴定了爬行动物肾组织ACE2基因,分析并讨论了ACE2对肾脏局部肾素血管紧张素系统(RAS)的作用机制。为了探索中华鳖肾组织的细胞学特性,本文还对生活于干旱环境的双峰驼的肾组织进行了比较研究。研究结果在细胞和分子水平上明确了中华鳖肾组织的微细特征和细胞组成及其ACE2的分布与基因克隆,分析了这些特征的机能意义,为中华鳖养殖、保护及资源利用等研究奠定基础。试验Ⅰ中华鳖肾脏的比较组织学研究对中华鳖肾脏进行了详细的光镜观察和结构参数测定及绘制出肾单位分布模式图,并与双峰驼肾组织进行了比较。结果表明,中华鳖肾脏由5-6个肾叶组成,肾叶包括被膜和实质两部分。实质无皮质与髓质之分,而是分为外周区和中间区,外周区与中间区厚度比约为3:1。肾单位无髓袢和球旁复合体结构,但可以区分为肾小体、颈段(或缺失)、近端小管、中间段、远端小管和集合管六部分。外周区主要分布有近端小管、集合管和大部分中间段。中间区主要分布有肾小体、小部分中间段和大部分远端小管。鳖肾小体平均直径约为120μm,在中间区的小叶内静脉两侧呈单个分散或2-4个聚集分布。颈段很短或缺失,细胞呈矮立方形,管腔狭窄。近端小管细胞呈柱状或锥体形,细胞高度约为20μm,胞质嗜酸性,腔面刷状缘明显,上皮由弱嗜伊红的亮细胞和嗜伊红的暗细胞组成。近端小管外径为60μm,长度最长,且呈高度盘曲状。中间段细胞呈矮立方形,细胞高度约为9μm,胞质少,胞核占大部分。中间段外径为26μm,在与近端小管过渡的部位,胞核呈密集排列,胞质呈弱嗜酸性。远端小管细胞呈立方形,管径粗细和细胞大小不一,细胞平均高度约为12μm,平均管径为37μm,细胞核排列不均匀,胞质弱嗜酸性,其长度仅小于近端小管。集合管管腔最大,外径为65μm。细胞呈柱状,高度约为17μm,胞质弱嗜酸性,位于外周区的近端小管之间,呈稍弯曲状。小叶内静脉和动脉分布在中间区的中央。肾间质少,肾小管之间几乎全部为毛细血管。中华鳖肾单位的分布规律和组成与爬行类的蜥蜴、短吻鳄等不完全相同,与哺乳类双峰驼的差异则更明显。双峰驼肾脏实质分为薄的皮质和宽厚的髓质,髓质与皮质厚度比为4:1。。肾小体很大,平均直径约为220μm。长袢型中间肾单位和髓旁肾单位比短袢型浅表肾单位多。皮质迷路内近曲小管远长于远曲小管。髓质外髓的直小血管形成发达的血管束,与泌尿小管束相间排列。内髓比外髓厚,外髓有次级肾锥体出现。双峰驼肾脏结构与其具有高浓缩尿液能力相一致。以上结果为爬行类肾单位研究及双峰驼肾单位结构与尿液浓缩能力的关系研究提供了形态学资料,同时亦为动物肾脏生理研究提供形态学依据。试验Ⅱ中华鳖肾单位超微结构的比较细胞学研究本试验利用光镜、透射电镜和扫描电镜对中华鳖肾单位超微结构进行了研究,并与双峰驼肾组织细胞结构进行了比较。结果表明,中华鳖肾小囊壁层上皮细胞间含有侧-基底细胞间隙,并有指状突起分布。脏层足细胞中含有少量线粒体、丰富的粗面内质网及许多核糖体,这些细胞器一直伴随突起分布到末端的足突,并可见宽大的足突附着在血管球基底膜上。由足细胞胞体发出宽大的初级突起,初级突起又发出多条宽窄不一的次级突起,次级突起再发出细小而密集的三级突起。这些结构最终形成由一个足细胞的突起伸向几条毛细血管并通过末端的足突附着于毛细血管基膜上的特殊结构。足细胞的这种形态在其它脊椎动物肾脏研究中未见报道。血管球基底膜较厚,为300-600 nm,内皮孔孔径约为80-185 nm,数量少,且呈区域性分布。中华鳖肾小球滤过屏障的形态特征可能与爬行动物具有很低的血管球滤过率相一致。近端小管微绒毛密集而长,顶端胞质含有发达的胞吞溶酶体结构,为尿液重吸收的主要部位；中间段上皮细胞由多纤毛细胞和非纤毛细胞组成,其主要作用为推送尿液向远端小管的运输；远端小管上皮细胞具有发达的侧指状镶嵌内褶和基底质膜内褶,为物质运输活跃的部位；集合管上皮中的亮细胞的顶端胞质含有许多黏液分泌颗粒,细胞核附近有同心圆形的高尔基体,而在暗细胞中有大量电子密度致密的具板层状嵴的线粒体。另外,集合管上皮细胞之间含有细胞间隙,间隙内布满了指状突起。集合管亮细胞分泌的黏液可以与管腔中的尿酸盐结合而形成屏障,以阻止细胞内水分进入管腔,起到保水的作用。与中华鳖肾脏明显不同,双峰驼足细胞中含有丰富的线粒体、粗面内质网和高尔基体,且微丝、微管亦发达。足细胞初级突起宽大,次级突起较短,由次级突起末端形成的足突密集附着于血管球基底膜。近端小管胞质顶端含有丰富的管泡结构,腔面微绒毛粗大、呈高而密集的分布,有些微绒毛顶端形成空泡状。远端小管腔面微绒毛短而稀少,胞质内线粒体丰富,质膜内褶发达。集合小管亮细胞数量多,线粒体少,而暗细胞中线粒体丰富。双峰驼肾单位的形态特点与其具有强大的尿液浓缩能力相符。本研究揭示了中华鳖肾单位的微细结构,并与双峰驼进行了比较,表明中华鳖具有很低的肾小球滤过率,其近端小管在尿液重吸收上发挥重要作用。中华鳖肾单位细胞结构与其它爬行动物存在一定差异,而与双峰驼的差异明显。试验Ⅲ中华鳖肾组织微细结构的性别差异利用甲苯胺兰半薄切片和透射电镜超薄切片对雌、雄中华鳖肾组织的微细结构进行了比较研究。结果表明,雌、雄中华鳖的近端小管、中间段上皮细胞结构存在一定差异。雄鳖的近端小管细胞之间含有侧-基底细胞间隙,侧细胞间隙内分布有指状突起,而细胞基底部与基膜之间形成基底间隙与迷路。雌鳖近端小管上皮无细胞间隙。雌、雄鳖中间段相邻细胞也表现出相似的形态差异。侧细胞间隙仅存在于雄性中间段上皮,间隙内分布有细长的指状突起,而在雌性中间段上皮中无细胞间隙。在雄性中华鳖近端小管上皮中含有三种细胞：主细胞、秃头细胞和基底细胞,与之不同,雌鳖的近端小管上皮则含有亮、暗两种上皮细胞。曾有人报道蛇与蜥蜴的肾脏中分布有性段结构,性段为雄性肾单位远端的膨大部位,其分泌物具有与生殖活动有关的功能。本研究在中华鳖肾脏未观察到性段结构,但首次发现雌、雄肾组织的近端小管和中间段的微细结构存在性别差异。这种差异是否与性段具有相似的生物学功能,还需要进一步生理学研究。但雄性近端小管上皮细胞之间存在明显的间隙应与物质运输有关,提示,雄性近端小管上皮的重吸收能力可能较雌性强。试验Ⅳ中华鳖肾组织的细胞化学特性利用光镜细胞化学方法对四种酶及两种活性物质在中华鳖肾单位的分布特性进行了详细地分析与研究。结果表明,各种酶及活性物质在肾单位中的分布不尽相同,表现出分布部位及反应强弱的不同。琥珀酸脱氢酶(SDH)为细胞内线粒体的标志酶,其主要分布在中间段、远端小管和集合管上皮细胞中,而在肾小球、近端小管中的反应较弱。碱性磷酸酶(ALPase)存在于物质交换活跃的部位,主要分布在近端小管刷状缘。ATPase在离子的跨膜转运及膜电位的调节方面起着关键作用,主要分布在近端小管刷状缘,而在中间段腔面为弱阳性。酸性磷酸酶(ACPase)作为溶酶体的标志酶,参与胞内磷酸基团的转移和代谢,其反应在近端小管刷状缘为强阳性,在肾小球足细胞处呈阳性。集合管胞质内含有大量ACPase阳性颗粒。PAS反应用来鉴定碳水化合物和大分子的糖结合物,在中华鳖肾脏中的分布范围广泛,主要分布于肾小球、近端小管、集合管的上皮细胞及所有肾小管的基底膜。集合管腔面显示PAS强阳性,血管球、远端小管细胞侧面、近端小管刷状缘为阳性,其它部位反应较弱。阿利新兰(AB)标记酸性粘蛋白,其主要分布于远端小管和集合管的腔面。甲苯胺兰(TB)反应显示了近端小管、中间段和集合管上皮中的亮、暗细胞。上述细胞化学反应结果表明,肾小球内皮细胞和系膜细胞含有丰富的糖原,为血管球滤过原尿的物质转运提供能量,而脏层足细胞具有磷酸基团转运能力；在近端小管上皮组织的原位显示了几种与物质转运有关的活性成分,表明中华鳖近端小管在原尿重吸收中起主要作用；远端小管和集合管细胞代谢旺盛,细胞腔面分泌的黏液物质可以润滑管腔,起到保水的作用。中间段代谢活动强,有利于纤毛向后段肾小管推送尿液；研究还表明中华鳖肾小管细胞类型较多。中华鳖肾单位的细胞化学特性不仅与哺乳类和鸟类有一定差异,也与其它爬行动物不完全相同。试验V中华鳖肾组织ACE2的免疫细胞化学研究采用免疫细胞化学反应研究了血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)在中华鳖肾脏中的分布及特点,并与双峰驼进行比较。结果首次显示,ACE2在爬行类肾脏中有分布,进一步证明特异性ACE2阳性反应见于中华鳖肾脏近端小管、足细胞、血管球基底膜和小叶内静脉内皮,而中间段、远端小管和集合管上皮弱阳性。ACE2在中华鳖肾单位不同部位的分布表明,其主要在肾小球和近端小管调节原尿的滤过及重吸收。与之相比,双峰驼肾脏ACE2在皮质部的分布比髓质部广泛,皮质部肾小球系膜细胞、近曲小管和集合小管为阳性,而远曲小管弱阳性。近直小管为阳性,远直小管弱阳性。髓质部集合小管、乳头管上皮为阳性,而细段和直小血管为阴性。这些结果表明ACE2在哺乳动物双峰驼肾脏中的分布比中华鳖更广泛。ACE2通过调节肾脏肾素-血管紧张素系统(RAS),影响肾脏的血流量,进而调节水盐代谢,而广泛分布的ACE2可能与双峰驼具有强大的尿液浓缩能力有关。试验Ⅵ中华鳖肾脏ACE2基因克隆及其遗传进化分析本研究从中华鳖肾脏组织中克隆ACE2基因,进一步确定ACE2在中华鳖肾脏中的存在,为下一步研究其功能提供分子基础。从中华鳖肾脏中提取总RNA,以Oligo dT-Adaptor为引物合成cDNA。根据人、斑马鱼、鸡的ACE2基因]mRNA保守序列设计引物,通过聚合酶链式反应,扩增出中华鳖ACE2基因的部分序列并进行序列分析。结果显示：克隆的这段中华鳖ACE2序列长度为355bp,并已将该基因序列提交到GenBank,登录号为：HM107424。其核苷酸序列与人、鸡和斑马鱼ACE2基因序列的同源性分别达到70.3%、80%和65.1%。推导的氨基酸同源性分别为63.8%、79.3%和56.9%。表明中华鳖肾脏ACE2与鸡、人的ACE2均有较高的同源性,其中,与鸡的同源性最高。通过遗传进化分析发现,中华鳖肾脏ACE2与鸟类亲缘关系最近,符合物种进化理论。进一步提示ACE2在中华鳖肾脏局部RAS系统中可能发挥重要作用。

全文目录

摘要  7-12
ABSTRACT  12-19
前言  19-21
第一篇文献综述  21-63
  第一章脊椎动物肾组织的细胞学研究  21-51
    第一节脊椎动物肾脏的类型与演化  21-25
    第二节鱼类肾组织的细胞学特点  25-29
    第三节两栖类肾组织的细胞学特点  29-34
    第四节爬行动物肾组织的细胞学特点  34-37
    第五节鸟类肾组织的细胞学特点  37-40
    第六节哺乳类肾组织的细胞学特点  40-45
    参考文献  45-51
  第二章爬行动物肾组织细胞学研究进展  51-57
    第一节爬行动物肾组织概况  51-52
    第二节爬行动物肾单位细胞特征  52-55
    参考文献  55-57
  第三章肾脏的肾素-血管紧张素系统研究  57-63
    第一节肾脏局部肾素血管紧张素系统概述  57-58
    第二节 ACE2对肾素-血管紧张素系统的调控  58-60
    参考文献  60-63
第二篇试验研究  63-139
  第四章中华鳖肾脏的比较组织学研究  63-77
    1 材料与方法  64-65
    2 结果  65-71
    3 讨论  71-73
    4 小结  73-74
    参考文献  74-77
  第五章中华鳖肾单位超微结构的比较细胞学研究  77-101
    1 材料与方法  78-79
    2 结果  79-94
    3 讨论  94-97
    4 小结  97-98
    参考文献  98-101
  第六章中华鳖肾组织微细结构的性别差异  101-109
    1 材料与方法  101-102
    2 结果  102-105
    3 讨论  105
    4 小结  105-107
    参考文献  107-109
  第七章中华鳖肾组织的细胞化学特性  109-121
    1 材料与方法  110-111
    2 结果  111-115
    3 讨论  115-117
    4 小结  117-118
    参考文献  118-121
  第八章中华鳖肾组织ACE2的免疫细胞化学研究  121-131
    1 材料与方法  122
    2 结果  122-125
    3 讨论  125-126
    4 小结  126-127
    参考文献  127-131
  第九章中华鳖肾脏ACE2基因克隆及其遗传进化分析  131-139
    1 材料与方法  131-133
    2 结果  133-135
    3 讨论  135-136
    4 小结  136-137
    参考文献  137-139
全文总结  139-141
论文创新点  141-143
附录Ⅰ 常规石蜡切片过程  143-144
附录Ⅱ 电镜切片的制备  144-145
附录Ⅲ SABC免疫细胞化学染色方法  145-146
附录Ⅳ 琥珀酸脱氢酶染色方法  146-147
附录Ⅴ 碱性磷酸酶染色方法  147-148
附录Ⅵ 酸性磷酸酶染色方法  148-149
附录Ⅶ 三磷酸腺苷酶的显示-硝酸铅法  149-150
附录Ⅷ 过碘酸-希夫反应  150-151
附录Ⅸ 阿尔新蓝染色方法  151-153
论文发表情况  153-155
致谢  155

中华鳖肾组织的比较细胞学研究及其ACE2的分布与基因克隆

内容摘要

全文目录

相似论文