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超分子纳米粒作为抗肿瘤药物和基因协同给药体系的研究

作　者: 范辉
导　师: 梁文权；汤谷平
学　校: 浙江大学
专　业: 药剂学
关键词: 超分子纳米粒 基因载体 聚乙烯亚胺 环糊精 金刚烷 阿霉素 TRAIL 协同给药
分类号: R943
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：合成一种基于环糊精／金刚烷的超分子纳米材料,能协同运载小分子抗肿瘤药物和治疗基因,考察其药物释放特点与转染效果,评价其体内外对肿瘤细胞生长的抑制作用以及抗肿瘤效果。方法：1-金刚烷甲酸(Ad-COOH)与阿霉素(Dox)通过N,N’-羰基二咪唑(CDI)偶合后,与环糊精-聚乙烯亚胺(PEI-CD)进行自组装主客体反应生成PEI-CD/Ad-Dox超分子纳米聚合物,对其进行化学、物理学及生物学特点进行表征。压缩并结合肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的基因质粒(pTRAIL),形成超分子纳米粒后,通过肿瘤细胞对超分子纳米粒的摄取、TRAIL蛋白的表达、对肿瘤细胞凋亡影响以及毒性等各方面的考察,来确定超分子纳米粒在体外对肿瘤细胞的抑制效果。以人卵巢癌细胞SKOV-3荷瘤裸鼠为动物模型,利用超分子纳米粒瘤内注射治疗后,观察小鼠肿瘤的生长情况以及生存期,以确定超分子纳米粒在体内治疗时的抗肿瘤疗效。结果：核磁共振氢谱、NOESY频谱、紫外-可见光谱、热重分析等理化表征确定了阿霉素成功结合金刚烷基并通过主客体连接与PEI-CD组成超分子复合物PEI-CD/Ad-Dox;凝胶电泳阻滞实验证实PEI-CD/Ad-Dox在N/P比小于3时即能完全压缩并结合质粒DNA；透射电镜和扫描电镜下所示超分子纳米粒是呈一定分散性的球形颗粒,在水、生理盐水和RPMI 1640细胞培养基等不同介质中具有适宜的粒径和Zeta电位,可用于基因转染；体外药物释放实验说明游离药物从超分子纳米粒中先是以一级动力学过程释放,然后逐渐改成零级释放,释放过程与pH有关,且具有缓释作用；细胞对超分子纳米粒的摄取、表达实验以及Western blot蛋白印迹实验进一步证明了药物与基因的协同入胞传递和基因表达过程；MTT细胞毒性实验证明了超分子纳米粒携带pTRAIL质粒可有效地抑制人卵巢癌细胞SKOV-3的增长,显示出较强的细胞毒性；通过流式细胞仪测得SKOV-3细胞经超分子纳米粒作用后,细胞周期被阻滞在G0/G1期,凋亡程度增加；TUNEL染色进一步显示了凋亡细胞的增多。瘤内注射超分子纳米粒后具有延长药物滞留时间与体内转染肿瘤的作用；在Balb/c裸鼠模型上进行肿瘤的原位注射治疗,SKOV-3卵巢肿瘤的生长明显受到抑制作用,HE组织染色显示肿瘤细胞凋亡增多,荷瘤小鼠的存活期得到延长。结论：本研究成功构建了协同运载抗癌药物和基因质粒的超分子纳米材料,首次证明在卵巢癌的治疗上,体内外均可提高肿瘤细胞对药物敏感性,体现出较好的协同增效作用,为化疗药物与基因药物的联合应用打下基础。

全文目录


致谢  5-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩写、术语中英文对照表  10-12
目次  12-17
第1章 绪论  17-38
  1.1 引言  17
  1.2 肿瘤的化学药物治疗  17-20
  1.3 肿瘤的基因治疗  20-24
  1.4 化疗药物和基因联合治疗  24-27
  1.5 本课题的提出与设计  27-29
  1.6 参考文献  29-38
第2章 基于环糊精/金刚烷主客体超分子纳米粒的构建与表征  38-64
  2.1 前言  38-39
  2.2 仪器与材料  39-41
    2.2.1 仪器设备  39-40
    2.2.2 实验材料  40-41
  2.3 实验方法  41-45
    2.3.1 超分子纳米聚合物的合成  41-42
      2.3.1.1 PEI-CD聚合物的合成  41
      2.3.1.2 Ad-Dox化合物的合成  41-42
      2.3.1.3 PEI-CD/Ad-Dox超分子聚合物的合成  42
    2.3.2 理化表征方法  42-45
      2.3.2.1 核磁共振氢谱(~1H-NMR)  42
      2.3.2.2 核欧佛豪瑟效应频谱(NOESY spectrum)  42
      2.3.2.3 紫外-可见光谱(UV-Vis)  42
      2.3.2.4 热重分析(TGA)  42-43
      2.3.2.5 凝胶电泳阻滞实验(Agarose Gel Retardation Assay)  43-44
      2.3.2.6 粒径和Zeta电位测定(Particle Size and ζ Potential Assay)  44
      2.3.2.7 透射电镜下形态观察(TEM)  44
      2.3.2.8 扫描电镜下形态观察(SEM)  44-45
  2.4 实验结果  45-57
    2.4.1 超分子纳米聚合物的合成  45-47
      2.4.1.1 PEI-CD聚合物的合成  45-46
      2.4.1.2 Ad-Dox化合物的合成  46
      2.4.1.3 PEI-CD/Ad-Dox超分子聚合物的合成  46-47
    2.4.2 理化表征结果  47-57
      2.4.2.1 核磁共振氢谱(~1H-NMR)  47-49
      2.4.2.2 核欧佛豪瑟效应频谱(NOESY spectrum)  49-50
      2.4.2.3 紫外-可见光谱(UV-Vis)  50-51
      2.4.2.4 热重分析(TGA)  51-52
      2.4.2.5 凝胶电泳阻滞实验(Agarose Gel Retardation Assay)  52-54
      2.4.2.6 粒径和Zeta电位测定(Particle Size and Zeta Potential Assay)  54-56
      2.4.2.7 透射电镜下形态观察(TEM)  56-57
      2.4.2.8 扫描电镜下形态观察(SEM)  57
  2.5 讨论  57-58
  2.6 实验小结  58-59
  2.7 参考文献  59-64
第3章 PEI-CD/AD-DOX超分子纳米粒体外效应评价  64-98
  3.1 前言  64-67
  3.2 仪器与材料  67-72
    3.2.1 仪器设备  67-68
    3.2.2 实验材料  68-72
  3.3 实验方法  72-78
    3.3.1 真核表达质粒的提取  72-73
    3.3.2 药物释放动力学实验  73-74
    3.3.3 MTT法测定细胞毒性  74
    3.3.4 细胞摄取与转染实验  74-75
    3.3.5 Western blot法检测蛋白的表达  75-76
    3.3.6 流式细胞法测定对细胞周期的影响  76
    3.3.7 流式细胞法测定对细胞凋亡的影响  76-77
    3.3.8 TUNEL法测定对细胞凋亡的影响  77-78
    3.3.9 数据统计分析  78
  3.4 实验结果  78-87
    3.4.1 药物释放动力学实验  78-80
    3.4.2 MTT法测定对细胞毒性  80-82
    3.4.3 细胞摄取与转染实验  82-83
    3.4.4 Western blot法检测蛋白的表达  83-84
    3.4.5 流式细胞法测定对细胞周期的影响  84-85
    3.4.6 流式细胞法测定对细胞凋亡的影响  85-86
    3.4.7 TUNEL法测定对细胞凋亡的影响  86-87
  3.5 讨论  87-90
  3.6 实验小结  90-92
  3.7 参考文献  92-98
第4章 PEI-CD/AD-DOX超分子纳米粒体内药效评价  98-117
  4.1 前言  98-99
  4.2 仪器与材料  99-100
    4.2.1 仪器设备  99
    4.2.2 实验材料  99-100
  4.3 实验方法  100-103
    4.3.1 荷瘤动物模型的建立  100
    4.3.2 体内药物滞留实验  100-101
    4.3.3 体内转染与表达实验  101
    4.3.4 肿瘤生长抑制实验  101-102
      4.3.4.1 在体肿瘤生长观察  101
      4.3.4.2 离体肿瘤大小比较  101-102
      4.3.4.3 肿瘤组织HE染色  102
    4.3.5 荷瘤裸鼠生存期观察  102
    4.3.6 数据统计分析  102-103
  4.4 实验结果  103-112
    4.4.1 体内药物滞留实验  103-104
    4.4.2 体内转染与表达实验  104-105
    4.4.4 肿瘤生长抑制实验  105-110
      4.4.4.1 在体肿瘤生长观察  105-107
      4.4.4.2 离体肿瘤大小比较  107-109
      4.4.4.3 肿瘤组织HE染色  109-110
    4.4.5 荷瘤裸鼠生存期观察  110-112
  4.5 讨论  112-113
  4.6 实验小结  113-115
  4.7 参考文献  115-117
第5章 全文总结  117-120
  5.1 全文结论  117-118
  5.2 主要创新之处  118
  5.3 今后研究方向  118-119
  5.4 展望  119-120
附录  120-121
综述  121-143
  参考文献  134-143
作者简介  143

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药剂学 > 制剂学
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