学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

细胞抗病毒天然免疫信号转导的调控机制

作　者: 李颖
导　师: 舒红兵
学　校: 武汉大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 干扰素信号转导核酸识别 LSM14A ISG56 MITA 负反馈调节
分类号: R392.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 173次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

长期以来,病毒感染诱导Ⅰ型干扰素表达的过程一直是细胞抗病毒天然免疫研究的热点。宿主细胞通过自身的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),从而启动下游信号级联反应,诱导Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferons)、促炎症细胞因子(proinflammatory cytokines)和趋化因子等的产生。在病毒感染宿主细胞的过程中,病毒的核酸可以被Toll样受体(Toll-likereceptors, TLRs)(如TLR3、7和9)、RIG-I样受体(RIG-I like receptors, RLRs)(如RIG-I和MDA5)和近年来发现的DNA受体(如DAI和IFI16)识别。其中RIG-I和MDA5识别病毒RNA后,招募其下游接头蛋白VISA(也叫MAVS、IPS-1和Cardif),一方面通过招募TRAF2/6活化IKK激酶复合物,激活转录因子NF-κB;另一方面通过招募TRAF3和TBK1,促进IRF3的磷酸化激活。活化的转录因子NF-κB和IRF3进入细胞核后,协同促进Ⅰ型干扰素基因的表达。MITA(也叫STING)是近年来发现的RLRs介导的抗病毒信号转导中另一个重要的接头蛋白,它通过与VISA相互作用,病毒感染后招募TBK1,通过自身寡聚化形成VISA-MITA-TBK1-IRF3复合物,促进TBK1对IRF3的磷酸化激活,从而介导Ⅰ型干扰素的表达。细胞抗病毒天然免疫中,宿主细胞对病毒感染的识别一直是研究的热点问题。尽管近十几年来的研究发现了许多PRRs,揭示了天然免疫中宿主对病原微生物的识别机制,但许多问题仍然需要进一步的研究。为了寻找参与病毒诱导的Ⅰ型干扰素信号转导的未知信号分子,我们以pGL3-ISRE为报告基因,进行了基因筛选。我们的研究发现,LSM14A能有效激活ISRE和IFN-p启动子,并显著协同仙台病毒(Sendai virus,SeV)和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type, HSV)感染诱导的Ⅰ型干扰素的表达。下调内源性LSM14A的表达显著抑制SeV感染早期诱导的Ⅰ型干扰素表达,同时,也抑制胞质dsRNA和dsDNA诱导的IFN-p启动子的激活。水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)空斑实验和新城疫病毒(Newcastle Disease virus, NDV)复制水平检测实验表明,LSM14A有效抑制病毒在细胞内的复制。此外,我们还发现LSM14A可以直接结合病毒RNA和DNA,作为一种新型胞质病毒核酸受体,通过与RIG-I或VISA相互作用,介导病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素的表达。为了进一步研究MITA在RLRs介导的抗病毒信号转导中的调控机制,我们进行了Flag-亲和层析实验,通过质谱分析鉴定得到了MITA相互作用蛋白ISG56。ISG56是最早被鉴定出可被病毒和Ⅰ型干扰素诱导表达的蛋白之一。我们的研究发现,过量表达ISG56抑制SeV感染诱导的IRF3、NF-κB和IFN-p启动子的激活；下调内源性ISG56的表达则得到相反的结果。同样的,过量表达ISG56抑制poly(I:C)诱导的抗病毒反应,促进VSV的复制；而下调内源性ISG56的表达则抑制VSV的复制。竞争性免疫共沉淀实验表明,ISG56通过与MITA结合,阻断MITA与其上游分子VISA和下游分子TBK1的相互作用。我们的研究表明,ISG56负反馈调控病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素表达和细胞抗病毒反应。我们的研究发现,LSM14A可能作为一种新型病毒核酸受体,参与病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素表达的信号转导,这将为细胞抗病毒天然免疫提供一种新的病原分子识别机制。此外,我们还发现了ISG56作为Ⅰ型干扰素诱导蛋白,负反馈调节病毒感染诱导Ⅰ型干扰素的表达,此项研究揭示了一种新的抗病毒天然免疫信号转导负反馈调控机制。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章研究背景  12-42
  第一节天然免疫对病原微生物的识别  12-24
    一、天然免疫概述  12-13
    二、天然免疫的模式识别受体  13-24
  第二节抗病毒天然免疫的信号转导及其调控机制  24-36
    一、抗病毒天然免疫信号转导概述  24-25
    二、Ⅰ型干扰素基因转录调控机制  25-27
    三、模式识别受体介导的天然免疫信号转导  27-33
    四、模式识别受体介导的信号转导中的调控机制  33-36
  第三节病毒诱导Ⅰ型干扰素表达的早、晚期事件和干扰素效应因子  36-42
    一、病毒诱导Ⅰ型干扰素基因表达的早、晚期事件  36-39
    二、干扰素诱导的效应因子  39-42
第二章实验材料和实验方法  42-53
  第一节实验材料  42-44
    一、细胞系、细胞培养和细胞因子  42
    二、病毒  42
    三、抗体  42-43
    四、表达载体  43
    五、核酸操作及检测试剂盒  43
    六、其它试剂  43-44
    七、耗材  44
    八、特殊仪器和设备  44
  第二节实验方法  44-53
    一、表达载体构建和质粒纯化  44-45
    二、细胞培养和瞬时转染  45-46
    三、原代细胞的分离培养和转染  46-47
    四、荧光素酶报告基因实验  47
    五、蛋白复合物的纯化和质谱鉴定  47-48
    六、免疫共沉淀和Western Blot检测  48-49
    七、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  49
    八、RT-PCR  49-50
    九、VSV空斑实验  50
    十、体外结合核酸实验  50-51
    十一、通过逆转录病毒载体构建稳定表达细胞系  51
    十二、细胞核质分离和亚细胞器分离  51-52
    十三、免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察  52-53
第三章实验结果和讨论一:新型核酸受体LSM14A的鉴定及其功能研究  53-87
  第一节研究背景与立项依据概述  53-54
  第二节实验结果  54-84
    一、基因库筛选  54-56
    二、过量表达LSM14A激活ISRE、NF-κB和IFN-β启动子  56-59
    三、下调内源性LSM14A表达抑制病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素表达  59-67
    四、LSM14A参与细胞抗病毒反应  67-68
    五、LSM14A参与SeV感染早期Ⅰ型干扰素的表达  68-71
    六、人肠癌HCT116细胞LSM14A-Flag-Knock-in细胞系的构建  71-72
    七、LSM14A定位于细胞质  72-73
    八、LSM14A结合poly(I:C)和poly(dA:dT)  73-75
    九、LSM14A与RIG-I、VISA相互作用  75-78
    十、LSM14A介导Ⅰ型干扰素表达需要RIG-I的参与  78-80
    十一、LSM14A、RIG-I、VISA与P-bodies的共定位  80-84
  第三节小结和讨论  84-87
第四章实验结果和讨论二:1SG56负反馈调节病毒诱导的Ⅰ型干扰素表达  87-107
  第一节研究背景与立项依据概述  87-88
  第二节实验结果  88-104
    一、ISG56和ISG54是MITA相互作用蛋白  88-91
    二、过量表达ISG56抑制病毒诱导的ISRE和IFN-β的激活  91-96
    三、内源性ISG56的表达下调促进病毒感染诱导的IFN-β激活  96-100
    四、ISG56负调控细胞抗病毒反应  100-101
    五、1SG56阻断MITA-VISA和MITA-TBK1的相互作用  101-104
  第三节小结和讨论  104-107
第五章研究总结和展望  107-109
参考文献  109-120
缩略词表  120-122
作者简历  122-124
致谢  124-125

细胞抗病毒天然免疫信号转导的调控机制

内容摘要

全文目录

相似论文