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重组毕赤酵母遗传稳定性的研究及其表达产物猪α干扰素的分离与纯化

作　者: 叶小飞
导　师: 李震；邹思湘
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪-α干扰素遗传稳定性凝胶过滤细胞病变抑制法
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究分为两部分,第一部分围绕与重组菌遗传稳定性相关的指标进行了研究,包括提取酵母基因组进行PCR鉴定、菌体生长状况(OD600)及蛋白表达量,同时研究了不同温度对表达过程中蛋白稳定性的影响。实验通过对本实验室构建的重组体毕赤酵母(外源基因PoIFN-α、宿主细胞KM71H、表达载体pPICZαA)进行了50次的摇瓶传代,以及在生长相的培养和诱导相的表达来获得了宿主菌菌体生长情况(OD600)和蛋白表达量的数据,以这两个指标为依据从外在方面初步判断菌种活力及目的基因是否存在。结果表明,不管是原始保存的菌株(S)还是经多次发酵表达后的菌株(N)在经过一个适应阶段后生长情况都趋于稳定,其中多次发酵后的菌体OD600大多在10-22之间,原始菌株OD600在19～25之间,前者比后者略低但差异不明显(P>0.05),表明菌种活力良好。蛋白表达方面,两组菌种在摇瓶条件下蛋白表达量都约为1g/L左右,经SDS-PAGE电泳和银染染色证实目的蛋白主要在16KD左右。为使实验结果具有可靠性,实验提取了不同代次酵母基因组DNA, PCR扩增后电泳条带大小和预期相同,测序证明确实为目的基因,从而证明目的基因(PoIFN-α)在体内稳定存在。最后为确定不同温度及表面活性剂对蛋白稳定性的影响,实验设计了两个不同诱导温度(20℃和30℃)作为比较,结果表明20℃诱导条件下目标蛋白主要以完整(21KD)和降解形式存在,30℃条件下以降解形式存在,浓度测定结果表明前者约是后者的两倍,证实温度是影响蛋白表达稳定性的关键因素,降低温度不仅能有效抑制蛋白的降解而且可提高表达量。第二部分对5L发酵罐发酵后的上清进行了分离纯化,分别采取了PEG6000沉淀法粗提取和Sephadex G-50凝胶过滤精细提取。前者采用正交实验设计3因素3水平,处理后目的蛋白绝大部分都能沉淀出来,通过离心即可达到与杂蛋白分离的目的,回收率接近80%,从极差(E)分析来看,对回收率影响最大的因素为pH值和PEG6000浓度,实验发现对蛋白的分离只能在弱酸性条件下进行,中性及碱性条件下蛋白变性为白色不溶性沉淀,PEG6000浓度为0.1g/ml时分离效果较好,较大的浓度影响沉淀与上清的分离效果,因此实验确定的最佳分离条件为pH6.0、NaCl 0.2mol/l、PEG6000 0.1g/ml。由于本实验采用毕赤酵母表达系统,上清中的杂蛋白少,且与目的蛋白分子量相差较大,将发酵液离心后经过最大分辨率为30KD的Sephadex 16/40凝胶柱后经电泳鉴定达到分离的目的,回收率在60%左右,纯度达到90%。最后对发酵后的干扰素原液及纯化后的蛋白进行了生物学活性方面的检测,结果显示原液蛋白的效价在1.28×105IU/ml,比活为2.46×104IU/mg, PEG6000纯化后蛋白效价为2.9×105IU/ml,比活为1.04×105IU/mg,凝胶纯化后蛋白效价为8×103IU/ml,比活为6.7×103IU/mg。

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摘要 5-7ABSTRACT 7-8第一章绪论 8-20 1 干扰素概述 8-9 2 猪α干扰素的研究现状 9-10 3 毕赤酵母表达系统 10-15 4 分离与纯化研究进展及意义 15-18 参考文献 18-20第二章毕赤酵母遗传稳定性的研究 20-30 1 引言 20 2 材料与方法 20-24 3 结果与分析 24-27 4 本章小结 27-29 参考文献 29-30第三章猪α干扰素的分离纯化 30-40 1 实验准备 30-33 2 猪α干扰素的PEG6000沉淀分离法 33-36 3 猪α干扰素的凝胶层析纯化 36-37 4 本章小结 37-38 参考文献 38-40第四章重组猪α干扰素抗病毒活性的测定 40-50 1 引言 40 2 材料与方法 40-43 3 结果与分析 43-48 4 本章小结 48-49 参考文献 49-50全文总结 50-52致谢 52

重组毕赤酵母遗传稳定性的研究及其表达产物猪α干扰素的分离与纯化

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