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猪Nanog基因在成纤维细胞与克隆胚胎中的过表达研究

作　者: 张力
导　师: 刘忠华
学　校: 东北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 猪 Nanog基因基因克隆核移植多能性基因信号通路基因
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Nanog是在早期胚胎发育和干细胞多能性维持中起到关键作用的基因之一。在大型哺乳动物中,有关Nanog基因功能的研究甚少。原因之一是目前为止仍未建立起真正的胚胎干细胞系并且缺乏类似在小鼠和人胚胎干细胞中对相关转录因子的细致研究。猪是人类重要的疾病模型和器官供给者,对猪的研究不仅对畜牧业的发展有很大的促进作用,而且对医学的研究也起着至关重要的作用。因此,在猪上对干细胞多能性基因的功能探索便显得尤为重要。本研究通过遗传修饰的方法,从猪MII期卵母细胞的RNA中克隆了与多能性维持紧密相关的转录因子Nanog的全长cDNA,并将其导入猪胎儿成纤维细胞,获得了过表达Nanog的细胞系,之后利用转基因的供核细胞构建出克隆胚胎并加以研究,试图对猪Nanog基因功能进行初步探索。经过实验得到了以下研究成果:(1)本研究通过RT-PCR方法从猪MII期卵母细胞总RNA中克隆了猪Nanog基因全长cDNA,序列分析表明该段基因由915个核苷酸碱基组成,与NCBI上猪Nanog编码序列进行BLAST比对分析同源性达98 %,只有第562位碱基发生了错义突变(A→G)和572位碱基突变(G→A),编码氨基酸分别由天冬氨酸(Asp)突变为苏氨酸(Thr),天冬酰胺(Asn)突变为色氨酸(Ser)。(2)成功构建了pEGFP-C1/Nanog和pcDNA3.1(+)/Nanog真核表达重组质粒,在脂质体介导下转染皮肤成纤维细胞,分别获得稳定转染和瞬时转染的细胞,免疫荧光结果表明Nanog蛋白可成功表达于成纤维细胞核内。(3)对表达GFP-NANOG融合蛋白的细胞,荧光鉴定结果表明无论是稳定或是瞬时表达的GFP-NANOG融合蛋白均位于细胞核内。(4)转染有pEGFP-C1/Nanog和pcDNA3.1(+)/Nanog重组质粒的猪胎儿成纤维细胞在G418筛选多天后均有若干干细胞样克隆形成。(5)猪胎儿成纤维细胞瞬时过表达Nanog基因后可瞬时激活Oct4 , C-myc和Sall4至5倍,2倍和5倍。(6)猪胎儿成纤维细胞瞬时过表达Nanog可瞬时激活JAK/STAT3通路(LIF, LIFr, Gp130)和下游激活基因(Stat3, C-myc)。(7)经悬浮培养,稳定表达Nanog的成纤维细胞能形成典型的类胚体,RT-PCR检测发现这些类胚体表达三个胚层分化标志基因。(8)经过G418筛选的稳定表达Nanog的体细胞,并不能维持多能性和信号通路相关基因的激活状态。(9)核移植实验结果发现未进行转染的成纤维细胞和分别稳定转染pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)/Nanog载体的成纤维细胞所构建的克隆胚胎在卵裂率、融合率、囊胚率上差异不显著,说明表达多能性转录因子Nanog的成纤维细胞与未经遗传修饰成纤维细胞所构建的克隆胚胎具有同样的发育潜能.(10)在克隆胚胎中高表达的Nanog基因可以在桑葚胚期激活内源Oct4,Sox2和Nanog基因表达至159, 93,和180倍。

全文目录

中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
1 前言  13-27
  1.1 Nanog 基因概述  13-15
    1.1.1 Nanog 基因的发现  13
    1.1.2 Nanog 基因结构  13-14
    1.1.3 Nanog 基因的时空表达  14-15
  1.2 Nanog 基因与ES 细胞中自我更新和多能性的维持  15-19
    1.2.1 Nanog 在ES 细胞和胚胎中作用  15-16
    1.2.2 Nanog 与内源信号通路调控  16-17
    1.2.3 Nanog 与转录因子的关系  17-19
  1.3 Nanog 与诱导多能性细胞建立  19-24
    1.3.1 Oct4,Sox2,C-myc 以及Klf4 引发的重编程机制  19-20
    1.3.2 Nanog 与Oct4，Sox2 的关系  20-21
    1.3.3 Nanog 与C-myc，Klf4 的关系  21-22
    1.3.4 Nanog 与Sall4 的关系  22-23
    1.3.5 Nanog 与体细胞核重编程  23-24
  1.4 Nanog 与胚胎发育  24-25
  1.5 本研究的目的和意义  25-27
2 材料与方法  27-46
  2.1 实验材料  27-32
    2.1.1 实验动物  27
    2.1.2 主要仪器与设备  27-28
    2.1.3 主要试剂及试剂盒  28
    2.1.4 常用试剂及配制  28-32
    2.1.5 主要的生物信息学网站及分析软件  32
  2.2 实验方法  32-46
    2.2.1 组织Realtime-PCR  32-35
    2.2.2 基因克隆  35-38
    2.2.3 感受态细胞的制备与转化  38
    2.2.4 质粒提取  38-39
    2.2.5 真核表达载体构建  39-40
    2.2.6 猪胎儿成纤维细胞转染、筛选与鉴定  40-41
    2.2.7 卵母细胞培养和核移植  41-42
    2.2.8 早期胚胎总RNA 提取  42
    2.2.9 引物设计  42-46
3 结果与分析  46-69
  3.1 Nanog 在成体组织中的表达  46
  3.2 猪Nanog 基因的克隆和真核表达载体构建表达  46-50
    3.2.1 猪Nanog 目的片段克隆与测序  46-49
    3.2.2 Nanog 真核表达载体的构建  49-50
  3.3 Nanog 基因在猪胎儿成纤维细胞中的过表达研究  50-62
    3.3.1 重组真核质粒瞬时和稳定转染的猪胎儿成纤维细胞  50-51
    3.3.2 Realtime-PCR 检测Nanog 在猪胎儿成纤维细胞中的过表达情况  51
    3.3.3 Nanog 免疫荧光检测  51-52
    3.3.4 稳定表达Nanog 猪胎儿成纤维细胞生长曲线测定  52
    3.3.5 过表达Nanog 后出现干细胞集落样克隆  52-56
    3.3.6 猪Nanog mRNA 在成纤维细胞中瞬时表达情况  56
    3.3.7 Nanog 瞬时过表达后全能性相关基因检测  56-57
    3.3.8 Nanog 稳定过表达后全能性相关基因检测  57-58
    3.3.9 Nanog 瞬时过表达后信号通路相关基因检测  58
    3.3.10 Nanog 稳定过表达后信号通路相关基因检测  58-59
    3.3.11 类胚体形成和三个胚层分化标志检测  59-60
    3.3.12 Realtime-PCR 反应的特异性  60-62
  3.4 转基因克隆胚胎的制作  62-69
    3.4.1 转基因克隆胚胎的体外发育  62-63
    3.4.2 GFP-NANOG 融合蛋白在早期胚胎核中的和定位  63-64
    3.4.3 Oct4，Sox2 和Nanog 在IVF, NT, NT-Nanog 胚胎中的表达  64-69
4 讨论  69-76
  4.1 猪Nanog 基因在成体组织中的表达  69
  4.2 猪Nanog 基因的克隆  69-70
  4.3 Nanog 促进克隆形成  70
  4.4 Nanog 促进细胞增殖  70-71
  4.5 Nanog 与转录因子调控网络  71-73
  4.6 Nanog 与内源信号通路  73
  4.7 Nanog 与成纤维细胞核重编程  73-75
  4.8 Nanog 与核移植胚胎发育能力  75-76
5 结论  76-77
致谢  77-78
参考文献  78-87
攻读博士期间已发表论文  87

猪Nanog基因在成纤维细胞与克隆胚胎中的过表达研究

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