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PR-XP1基因的克隆及在C6/36耐药细胞株中抗性的初步研究

作　者: 段晓雷
导　师: 刘虎岐
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 淡色库蚊氯菊酯抗性 RACE 生物信息学分析耐药细胞株
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蚊虫作为全球广泛分布的最主要的医药害虫,传播多种致命疾病,严重威胁人类的健康。目前防控蚊虫危害的主要手段仍是化学防治;其中又以拟除虫菊酯类杀虫剂的使用最为广泛;然而其大量、长期的使用已使蚊虫产生了越来越严重的抗药性。因此,探明蚊虫针对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性机理,尤其抗性相关基因及其功能的研究就是非常必要的。长期以来,由于研究对象的复杂性以及研究技术的限制,目前对淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因及其功能仍知之甚少。为了探索抗性淡色库蚊中全新的氯菊酯抗性相关基因并在细胞水平初步研究其抗性功能,本课题以抗性品系淡色库蚊与蚊虫C6/36细胞为研究对象,开展相关工作。首先,采用了异硫氰酸胍法、Trizol法、Trizol改良法、Trizol+ CTAB法与CTAB法五种不同RNA提取方法对适合抗性品系淡色库蚊总RNA提取的最佳方法进行了探讨。通过对RNA纯度、浓度检测以及利用荧光实时定量PCR技术对不同基因的模板绝对值的监测验证,初步明确了本实验室首创Trizol + CTAB法是从淡色库蚊中提取总RNA的最佳方法,可以为淡色库蚊杀虫剂抗性相关基因克隆及其后续研究提供了新的模板获取技术。其次,根据库蚊抗性相关EST(NCBI登录号为EC093826.1)设计基因特异性引物(GSP),利用了SMART-RACE技术,克隆出了目的基因5’/3’-末端序列,并进一步拼接、克隆得到了cDNA全长序列;再使用NCBI ORF finder软件定位其开放阅读框。结果显示,这是一条cDNA全长为2004 bp的全新基因,将其命名为PR-XP1,其编码蛋白为249个氨基酸。而后通过同源性比对、分子系统进化树构建、编码蛋白理化特性预测、疏水性及跨膜区预测、信号肽位点预测、磷酸化位点分析等生物信息软件的运用,对PR-XP1基因及其编码蛋白进行了评估与预测。结果表明,PR-XP1基因属于一个昆虫中独有的短序列“Hypothetic”蛋白基因家族;该基因编码蛋白具有特异的U型结构疏水性跨膜区,且具有很多磷酸化位点,因而推测其功能与杀虫剂抗性相关。其抗性相关也进一步被荧光实时定量PCR(相对定量)的监测结果所证实:PR-XP1基因在抗性品系蚊中表达量高于敏感品中的1.11倍。第三,蚊虫抗性相关基因的功能研究无论是利用基因沉默技术还是转基因诱导方法,其细胞水平研究都必须有一个适合的抗性模型。基于此,我们采用MTT法检测了氯菊酯对蚊虫C6/36细胞杀伤作用(半数致死浓度为517.64μg/ml);并根据该数据计算后,利用逐步冲击法成功构建了在含300μg/ml氯菊酯的培养液中稳定生长及传代的耐药细胞株,并且还将继续筛选。最后,利用半定量RT-PCR方法检测了此前刚克隆获得的PR-XP1基因在该耐药细胞株中得相对表达量为普通细胞株的1.7倍以上。综上所述,本研究为在淡色库蚊中研究抗性基因提供了总RNA提取的最佳方法;克隆了氯菊酯抗性相关基因PR-XP1并分析了相关的生物信息,以及监测了其抗性超量表达现象;并初步建立了蚊虫C6/36氯菊酯耐药细胞株以及首次验证了抗性相关基因在该耐药细胞株中的表达差异,为相关抗性基因功能的研究和蚊虫抗药性机制的探明提供了重要线索。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章文献综述  13-29
  1.1 蚊虫危害、防治和杀虫剂抗性的概述  13-15
  1.2 昆虫抗药性机理  15-18
    1.2.1 代谢抗性  15-16
    1.2.2 靶标抗性  16-18
  1.3 差异表达基因的克隆与分析技术  18-23
    1.3.1 差异表达基因的传统克隆技术  18-19
    1.3.2 表达序列标签（Expressed sequence tag, EST）  19
    1.3.3 cDNA 阵列杂交技术(Hybridization analysis of arrayed cDNA library)  19
    1.3.4 抑制性差减杂交(Suppression subtractive hybridization, SSH)  19-20
    1.3.5 cDNA 末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)  20-23
    1.3.6 Real-Time 实时定量PCR (real-time fluoro-genetic quantitative PCR)  23
  1.4 蚊虫细胞的培养与筛选  23-26
    1.4.1 蚊虫细胞的培养  23-24
    1.4.2 半数致死浓度的测定  24-25
    1.4.3 耐药性细胞株的建立  25-26
  1.5 淡色库蚊杀虫剂抗性相关基因研究现状  26-28
    1.5.1 Para-型钠离子通道基因的研究  26
    1.5.2 跨膜蛋白基因的研究  26-27
    1.5.3 细胞色素P450 家族的研究  27
    1.5.4 乙酰胆碱酯酶基因的研究  27
    1.5.5 蚊核糖体蛋白基因的研究  27
    1.5.6 丝氨酸蛋白酶家族的研究  27-28
  1.6 研究内容和意义  28-29
第二章从淡色库蚊中提取总RNA 五种不同方法的比较  29-38
  2.1 材料  29-30
    2.1.1 供试蚊虫  29
    2.1.2 主要试剂  29-30
    2.1.3 仪器及耗材  30
  2.2 实验方法  30-33
    2.2.1 RNA 提取前的准备及处理工作  30
    2.2.2 总RNA 的提取  30-31
    2.2.3 RNA 核酸浓度检测与电泳检测  31
    2.2.4 总RNA 的纯化  31
    2.2.5 反转录反应及检测  31-32
    2.2.6 实时荧光定量（标准曲线法绝对定量）  32-33
  2.3 结果与分析  33-36
    2.3.1 五种方法获得总RNA 质量、产量比较  33
    2.3.2 五种方法获得总RNA 电泳检测结果  33-34
    2.3.3 五种总RNA 提取方法的耗时比较  34
    2.3.4 总RNA 的纯化结果  34
    2.3.5 cDNA 第一链合成后的质量检测  34
    2.3.6 RT—PCR 产物的电泳结果分析  34-35
    2.3.7 五种方法获得的总RNA 的实时定量比较  35-36
  2.4 讨论  36-38
第三章基因PR-XP1 全长cDNA 克隆与生物信息学分析，及其在抗性和敏感型库蚊中的表达差异分析  38-55
  3.1 材料  39
    3.1.1 实验蚊虫  39
    3.1.2 主要的酶与试剂  39
    3.1.3 仪器设备  39
  3.2 方法  39-43
    3.2.1 淡色库蚊抗性与敏感型蚊虫的总RNA 提取  39
    3.2.2 cDNA 第一链的合成（非RACE 型）  39
    3.2.3 cDNA 第一链的合成（SMART-RACE 型）  39-40
    3.2.4 淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因的3＇、5＇RACE 扩增  40
    3.2.5 RACE 产物的回收与测序  40-41
    3.2.6 全长cDNA 的扩增  41-42
    3.2.7 生物信息学分析  42
    3.2.8 RP-XP1 基因的荧光定量引物的设计与检测  42
    3.2.9 荧光定量 PCR 对 RP-XP1 基因在抗性与敏感型淡色库蚊中表达差异的监测  42-43
  3.3 结果与分析  43-53
    3.3.1 抗性与敏感型淡色库蚊的总RNA 提取  43-44
    3.3.2 cDNA 第一链的合成  44
    3.3.3 淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-XP1 的克隆  44
    3.3.4 PR-XP1 基因的全长序列及编码氨基酸序列分析  44-46
    3.3.5 PR-XP1 基因的生物信息学分析  46-51
    3.3.6 β-ACTIN 和PR-XP1 基因的扩增  51
    3.3.7 抗性品系与敏感品系蚊中PR-XP1 基因的表达  51-53
  3.4 讨论  53-55
第四章 C6/36 氯菊酯耐药细胞株的建立以及 PR-XP1 基因在 C6/36 耐药与普通细胞株中表达水平的研究  55-67
  4.1 材料  55-56
    4.1.1 细胞株  55
    4.1.2 主要试剂  55
    4.1.3 仪器及耗材  55-56
  4.2 实验方法  56-59
    4.2.1 C6/36 细胞的传代培养  56
    4.2.2 C6/36 细胞的冻存与复苏  56
    4.2.3 氯菊酯对C6/36 细胞半数致死浓度的测定  56
    4.2.4 C6/36 细胞氯菊酯耐药细胞株的筛选  56-57
    4.2.5 C6/36 细胞生长曲线的测定  57
    4.2.6 C6/36 细胞总RNA 的提取  57
    4.2.7 cDNA 第一链的合成  57
    4.2.8 半定量RT-PCR 体系的建立  57-59
  4.3 结果与分析  59-65
    4.3.1 不同浓度氯菊酯对C6/36 细胞的杀伤作用  59-60
    4.3.2 氯菊酯对C6/36 细胞半数致死量的测定结果  60
    4.3.3 耐药细胞株筛选结果  60-61
    4.3.4 C6/36 细胞总RNA 提取结果  61-62
    4.3.5 C6/36 细胞总RNA 电泳图谱分析  62
    4.3.6 PR-XP1 和β-ACTIN cDNA 模板退火温度的确定  62-63
    4.3.7 半定量RT-PCR 循环数的确定  63-64
    4.3.8 PR-XP1 基因在 C6/36 耐药细胞株与正常细胞株表达差异的半定量 RT-PCR 结果  64-65
  4.4 讨论  65-67
第五章结论与展望  67-69
  5.1 主要结论  67
  5.2 研究展望  67-69
参考文献  69-76
附录  76-81
  附录1 主要溶液的配制  76-77
  附录2 实时定量实验扩增曲线及溶解曲线  77-79
  附录3 英文缩略词表  79-80
  附录4 主要仪器设备  80-81
致谢  81-82
作者简介  82

PR-XP1基因的克隆及在C6/36耐药细胞株中抗性的初步研究

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