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油桐油体蛋白等基因的克隆及生物信息学分析

作　者: 龙洪旭
导　师: 陈洪；谭晓风
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 森林培育
关键词: 油桐脂肪酸合成 oleosin SAD FAD3去饱和酶 FAD9去饱和酶 cDNA克隆 RACE RT-PCR
分类号: S794.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

油桐原产我国,是我国重要的木本油料树种之一。桐油是优质干性油,桐油主要成分是以桐酸为主的不饱和脂肪酸,具有重要的工业用途。桐油还是制备生物柴油的优质原料。但桐油存在不饱和脂肪酸含量过高的问题。本研究以对年桐近成熟种子为材料,通过构建油桐cDNA文库、简并PCR, RACE技术,RT-PCR等方法,分离克隆了oleosin、FAD3、FAD9等油桐油脂贮藏、合成的相关基因,为通过分子生物学方法来调控脂肪酸代谢途径、改良油桐的脂肪酸成分提供科学的基础。1.油桐油体蛋白oleosin基因的分离鉴定。在本实验室构建的油桐种子cDNA文库中,通过EST序列blast分析,挑取两个克隆,用通用引物T3、T7进行扩增,并回收测序,结果表明此两个VF_oleⅠ、VF_oleⅡ均为全长cDNA,长度分别为738bp,838bp,分别编码137、154个氨基酸。通过与别的物种油体蛋白基因氨基酸序列的比对分析,可知油桐中油体蛋白基因N端、C端保守性均较差,中间区域保守性较高,且均含有脯氨酸节结构。通过亲缘进化关系分析可知VF_oleⅡ与麻疯树oleosin2基因在亲缘进化关系上最近,氨基酸序列相似性为82%；而VF_oleⅠ则和麻疯树oleosin3以及蓖麻具有较近的亲缘关系,氨基酸序列相似性分别为84%、77%。这两个油体蛋白已提交至GenBank,登录号分别为GU245884、GU245885。2.油桐SAD基因的克隆及序列分析。通过在GenBank中搜索大戟科植物的SAD基因序列,进行多序列比对,设计简并引物,扩增油桐SAD基因的编码区序列。以对年桐近成熟种子为材料提取RNA,反转录成单链cDNA,进行简并PCR扩增。SAD的编码区分别长1179bp,编码392个氨基酸。将序列提交至GenBank中,登录号为GU363502。对SAD的DNA序列和氨基酸序列进行了生物信息学分析。对年桐SAD与千年桐和麻疯树此基因相似性分别达96%、91%。SAD蛋白分子量为45217.7Da,等电点5.99,不稳定系数41.88,属于不稳定性蛋白,整体上表现出亲水性,无跨膜结构。可能不存在信号肽的切割位点,是一个非分泌性蛋白；此蛋白质二级结构中以a螺旋、无规卷曲为主,模体搜索结果存在N-糖基化位点、依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点等多种功能结构域,SAD蛋白还存在一个FA desaturase 2结构域。3.FAD3、FAD9脱饱和酶基因cDNA克隆及序列分析。在GenBank中搜索油脂FAD3、FAD9脂肪酸脱饱和酶基因序列,通过多序列比对寻找该类基因的保守区,在保守区设计简并引物。通过RT-PCR扩增,分别得到了486bp、360bp片段。DNA测序及序列分析表明,这两个基因片段分别为油桐FAD3和FAD9脱饱和酶基因的部分cDNA。根据简并RT-PCR获得的油桐FAD3和FAD9脱饱和酶基因的部分cDNA序列信息设计用于扩增这两个基因完整cDNA末端的3’RACE和5’RACE特异引物。以对年桐近成熟种子为材料提取总RNA,逆转录制备RACE readycDNA,进行RACE扩增。FAD3的3’RACE和5’RACE扩增片段长度分别为1200bp、550bp; FAD9的3’RACE和5’RACE扩增片段长度分别为470bp、900bp。分别将FAD3、FAD9的简并片段、RACE片段进行人工拼接,预测起始密码子和终止密码子位置,在起始密码子和终止密码子附近设计引物；通过RT-PCR,扩增这两个基因的完整编码区。FAD3、FAD9的编码区分别长1344bp、939bp。将序列提交至GenBank中,登录号为GU564350、GU564349。对FAD3、FAD9的DNA序列和氨基酸序列进行了生物信息学分析。FAD3全长cDNA序列与蓖麻的此类基因相似性最高,达到83%,FAD9基因和蓖麻的delta9 desaturase相似性达84%。在线蛋白质分析结果表明,FAD3蛋白质分子量51660.6 Da,等电点8.25,属于稳定性蛋白。有七个可能性较大的跨膜区域,可能不存在信号肽的切割位点,是一个非分泌性蛋白,二级结构中主要以α螺旋结构和无规则卷曲为主,存在N-糖基化位点、依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点等多种功能结构域；存在Cyt-b5结构域、FA_desaturase结构域。与脂肪酸脱饱和酶功能相吻合。FAD9基因蛋白质分子量36213.5Da,等电点8.62,属于稳定性蛋白。有五个可能性较大的跨膜区域,不存在信号肽的切割位点,是一个非分泌性蛋白；蛋白质二级结构以α螺旋、无规卷曲为主；模体搜索显示FAD9蛋白存在N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位点等多个功能结构域；FAD9蛋白还存在一个FA desaturase结构域。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-12
1 绪言  12-24
  1.1 油桐概述  12
  1.2 油桐分子生物学研究进展  12-15
    1.2.1 油桐分子标记研究  12-13
    1.2.2 油桐cDNA文库和EST文库构建  13-14
    1.2.3 油桐其它分子水平研究  14-15
  1.3 油桐制备生物柴油研究进展  15-18
    1.3.1 国内外生物柴油研究进展  15-17
    1.3.2 生物柴油的优点  17
    1.3.3 桐油制备生物柴油研究进展  17-18
  1.4 油体蛋白基因概述  18-19
  1.5 脂肪酸脱饱和酶  19-22
    1.5.1 FAD3脱饱和酶基因  20
    1.5.2 SAD和FAD9脱饱和酶基因  20-22
  1.6 本研究目的意义  22-23
  1.7 本研究技术路线  23-24
2 油桐油体蛋白基因的分离鉴定  24-32
  2.1 材料与方法  24-26
    2.1.1 材料  24
    2.1.2 实验方法  24-26
  2.2 结果与分析  26-30
    2.2.1 油桐cDNA文库及EST文库的构建质量  26
    2.2.2 菌液PCR检测电泳结果  26-27
    2.2.3 油桐油体蛋白基因生物信息学分析  27-30
  2.3 讨论  30-32
3 油桐SAD基因的克隆及生物信息学分析  32-48
  3.1 材料与方法  32-38
    3.1.1 实验材料  32
    3.1.2 实验方法  32-38
  3.2 结果与分析  38-46
    3.2.1 油桐近成熟种子总RNA提取  38
    3.2.2 简并PCR的电泳结果  38
    3.2.3 菌液PCR检测重组子  38-39
    3.2.4 重组子的测序及序列分析  39-46
  3.3 讨论  46-48
    3.3.1 油桐种子总RNA提取  46-47
    3.3.2 简并PCR  47-48
4 油桐FAD3和FAD 9基因的克隆及生物信息学分析  48-82
  4.1 材料与方法  48-59
    4.1.1 实验材料  48
    4.1.2 实验方法  48-59
  4.2 结果与分析  59-79
    4.2.1 油桐近成熟种子总RNA提取  59-60
    4.2.2 简并PCR的电泳结果  60-61
    4.2.3 3’RACE结果电泳检测  61-62
    4.2.4 3’RACE重组子电泳检测  62
    4.2.5 5’RACE结果电泳检测  62-63
    4.2.6 5’RACE重组子电泳检测  63
    4.2.7 全长cDNA扩增电泳检测  63-64
    4.2.8 菌液PCR检测全长cDNA重组子  64
    4.2.9 FAD3和FAD9的生物信息学分析  64-79
  4.3 讨论  79-82
    4.3.1 RACE技术  79-81
    4.3.2 降落PCR  81
    4.3.3 生物信息学分析  81-82
5 结论与创新  82-84
  5.1 结论  82
  5.2 创新  82-84
参考文献  84-90
附录A:常用实验药品配方  90-92
附录B:缩略词  92-93
附录C:GenBank提交序列信息  93-98
附录D:攻读硕士学位期间的主要学术成果  98-100
致谢  100

油桐油体蛋白等基因的克隆及生物信息学分析

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