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Mycobacterium tuberculosis H37Ra毒力丢失机制

作　者: 吕亮东
导　师: 赵国屏
学　校: 复旦大学
专　业: 微生物学
关键词: 结核分枝杆菌 H37Ra MazG RelA NTP焦磷酸水解酶氧化压力应答比较基因组学
分类号: R521
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

由Mycobacterium tuberculosis (Mtb)感染引起的肺结核病是目前全球最严重的传染性疾病之一。Mtb是一种非常成功的病原菌,全世界约有1/3人口(18.6亿)携带有结核分枝杆菌,每年约有900万新增病例,150-200万人死于结核病。尽管科学家们花费了数十年的时间来开发结核病的治疗性药物和预防性疫苗,该病仍然对公共安全构成了巨大威胁。随着多重耐药菌株的不断出现和HIV/TB共感染带来的威胁,新的药物和疫苗的研发显得越来越紧迫。因此,对Mtb致病机理的阐明以及在此基础上的药靶开发就显行越来越重要。M. tuberculosis H37Ra是一株无毒菌株,其姊妹株H37Rv是结核病研究的实验室标准株,两个菌株都由H37演化而来。因此,阐明H37Ra毒力丢失的基础对于了解Mtb的致病机理有着重大意义。本论文通过H37Ra全基因组测序以及与H37Rv的比较基因组学分析鉴定了H37Ra发生的所有突变。随后我们对发生在H37Ra MazG上的A219E突变(MtMazG[A219E])进行了深入研究。我们首先鉴定了MtMazG的酶学特性,并从酶学活性和催化机理水平证实了MtMazG[A219E]是一个loss-of-function突变：最后,我们以Mycobacterium smegmatis为模式菌株,揭示了MtMazG参与氧化压力应答的生理功能和分子机理。本研究结果提示MtMazG[A219E]是H37Ra毒力丢失的潜在原因之一。本研究从以下四个方面展开。第一部分利用Shotgun测序策略,我们获得了完整的M. tuberculosis H37Ra (ATCC25177)全基因组高分辨率序列。通过与H37Rv基因组序列进行比较、H37Rv基因组重测序以及与第三株菌CDC1551的比较,我们最终确定了130个与H37Ra的表型有关的突变。通过对这些突变的性质、发生的部位和对蛋白功能的影响进行分析,我们对H37Ra毒力丢失的机理做出了系统的解释。第二部分我们在体外表达了分枝杆菌MazG蛋白,并建立了NTP-PPase活力测定的体系。研究发现,MtMazG不但具有水解正常(d)NTP的能力,还能以较高的亲和力结合并水解dUTP和8-oxo-dGTP,说明MtMazG具有潜在的house-cleaning功能。这是首次证实MazG家族蛋白具有降解氧化损伤产生的不正常(d)NTP的活力。进一步研究发现MtMazG是一个单NTP-PPase结构域蛋白,活性形式为四聚体,其N端和C端结构域的功能未知,这种结构域组合形式与目前已鉴定的MazG蛋白都不相同。第三部分通过测定不同条件下MtMazG[A219E]的水解活力,我们发现A219E突变导致MtMazG的水解活力降至野生型蛋白的7%以下,提示这是一个loss-of-function突变。通过对A219残基在E.coli MazG中所处空间位置的分析,我们推测该突变可能会影响Mg2+结合部位的电荷分布和结构。随后的实验证实,MtMazG[A219E]对Mg2+的亲和力下降了6倍；圆二色谱分析表明,在Mg2+存在的条件下,MtMazG[A219E]的二级结构发生了显著的变化。该结果提示,A219E突变改变了Mg2+结合部位的电荷分布和结构,从而破坏了MtMazG的NTP-PPase活力。第四部分利用噬菌体特异性转导技术,我们在M. smegmatis mc2 155中构建了mazG缺失突变株。MtMazG不参与饥饿应答,提示其在生理功能上不同于E.coli MazG。MazG被敲除的M. smegmatis菌株在氧化压力下的存活能力比野生株显著下降。在氧化压力下,relA的表达在mazG缺失的M. smegmatis中被抑制。这一表型不能被MazG[A219E]互补,提示MazG的NTP焦磷酸水解酶活力对relA的表达具有特异性的调控作用。MazG的N端和C端结构域对NTP-PPase活力是必需的；而E.coli MazG的A141E突变则没有影响其NTP-PPase功能。以上研究结果提示MtbMazG在酶学,结构和生理功能上都不同于E. coli MazG。综上所述,本研究以比较基因组学研究为起点,揭示了MtMazG的生化活性及生理功能并阐明了A219E突变导致NTP-PPase活力丧失的机理。我们的研究表明,MtbMazG在酶学,结构和生理功能上都不同于E. coli MazG,是一个新的NTP焦磷酸水解酶,并可能与Mtb的致病能力相关。

全文目录

符号与缩略语说明  8-9
摘要  9-11
Abstract  11-14
第一章引言  14-48
  1 关于Mycobacterium tuberculosis H37Ra  14-23
    1.1 H37Ra的演化  14-16
    1.2 H37Ra的表型特点  16-20
    1.3 H37Ra毒力丢失机制的研究  20-23
  2 MazG家族蛋白  23-27
    2.1 MazG蛋白家族成员  23-24
    2.2 MazG蛋白结构特点  24-26
    2.3 MazG功能研究进展  26-27
  3 结核分枝杆菌胞内生存与压力应答  27-35
    3.1 氧化压力应答  27-32
    3.2 抗酸应答  32-33
    3.3 饥饿、缺氧与休眠  33-35
  4 本课题的研究背景和意义  35-36
  参考文献  36-48
第二章 H37Ra与H37Rv的比较基因组学研究  48-70
  1 前言  48
  2 材料与方法  48-54
    2.1 实验材料与试剂  48-51
    2.2 实验方法  51-54
  3 结果  54-63
    3.1 H37Ra基因组测序及分析  54-56
    3.2 H37Ra毒力丢失机理的探究  56-62
    3.3 启动子突变基因的转录水平变化  62-63
  4 讨论  63-66
  5 小结  66
  参考文献  66-70
第三章 MtMazG NTP焦磷酸水解功能及其生化特点  70-88
  1 前言  70
  2 材料与方法  70-78
    2.1 实验材料与试剂  70-73
    2.2 实验方法  73-78
  3 结果  78-83
    3.1 MazG蛋白的表达与纯化  78
    3.2 酶促反应体系的建立  78-80
    3.3 动力学常数及底物谱  80-82
    3.4 MtMazG蛋白多聚体形式的研究  82-83
  4 讨论  83-86
  5 小结  86
  参考文献  86-88
第四章 A219E突变导致MtMazG活力降低的机理研究  88-102
  1 前言  88
  2 材料与方法  88-91
    2.1 实验材料与试剂  88-89
    2.2 实验方法  89-91
  3 结果  91-98
    3.1 A219残基空间位置的分析  91-93
    3.2 MsMazG A222E定点突变  93
    3.3 A219E突变对MtMazG活力的影响  93-95
    3.4 Mg~(2+)对MtMazG水解活力的激活作用  95-97
    3.5 对MtMazG[A219]结构变化的圆二色谱分析  97-98
  4 讨论  98-99
  5 小结  99
  参考文献  99-102
第五章结核分枝杆菌MazG的功能研究  102-132
  1 前言  102
  2 材料与方法  102-111
    2.1 实验材料与试剂  102-103
    2.2 实验方法  103-111
  3 结果  111-125
    3.1 mazG敲除菌株及互补菌株的构建  111-117
    3.2 mazG的表型和功能  117-120
    3.3 mazG的表达调控及其对relA转录水平的影响  120-122
    3.4 EcMazG与MtMazG功能差异的生化基础  122-125
  4 讨论  125-128
  5 小结  128
  参考文献  128-132
发表文章  132-134
致谢  134-136

Mycobacterium tuberculosis H37Ra毒力丢失机制

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