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油菜隐性细胞核雄性不育基因区段的比较分析与特异标记的开发

作　者: 马磊
导　师: 杨光圣
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甘蓝型油菜隐性核不育基因比较基因组学微观共线性精细定位
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 14次
引　用: 1次
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内容摘要

甘蓝型油菜是由甘蓝和白菜杂交天然加倍后形成,基因组中包含A、C两个基因组的信息。由于A、C基因组是在大约400万年前由共同的芸薹属祖先分化而来,二者具有高度保守的基因组结构和微观共线性(Rana et al.,2004)。因此,甘蓝型油菜的遗传作图研究很可能会受到同源基因组的影响。从DNA序列水平上研究A、C基因组之间的变异,并在微观共线性良好的同源基因组之间区别二者,将为甘蓝型油菜的相关研究提供帮助。9012AB是一种新的甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育材料,具有败育彻底,不育性稳定,恢复源广泛的特点,因此在三系配套育种中具有重要的利用价值。陈凤祥等对该材料的研究表明:其育性受到两对重叠隐性不育基因(ms3ms3、ms4ms4)和一对隐性上位抑制基因(rfrf)互作控制。何俊平等已将其中一个不育基因ms3精细定位在0.034cM的遗传区间。物理作图表明该区间最少由6个BAC克隆构成的一个完整的重叠群所覆盖,并利用亚克隆测序的方法获得其中包含目标基因的一个BAC克隆。为了进一步开发与Ms3紧密连锁的标记,并验证BAC克隆筛选的结果及比较该区间在甘蓝和白菜基因组之间的微观共线性关系,从而为Ms4的研究提供可能的便利,本研究从上述BAC克隆测序序列中随机选择20kb的区域在不同材料中进行比较测序并分析,获得如下主要结果:1.根据20kb的区域设计18对引物,其扩增产物理论上能够构成一个完整的重叠群并完全覆盖该区间。利用这18对引物在9012A、9012B、白菜和甘蓝中扩增,扩增产物拼接后共得到三种材料52个区段序列信息。2.对所得材料的区段序列进行比对分析发现,甘蓝型油菜Tapidor、9012A、9012B、白菜和甘蓝之间存在较好的微观共线性,且甘蓝型油菜9012A和白菜之间的相似性高,9012B、Tapidor和甘蓝之间的相似性高。参考模式植物拟南芥信息进一步基因预测发现:该区段3个对应基因方向相同,外显子区域一致且比较保守;内含子区段序列存在碱基的突变、插入或缺失。根据测序所得序列差异较大的区域,开发9012A和9012B之间6对多态性标记,白菜和甘蓝之间的多态性标记DM1和HWY。3.经重组单株验证后,根据9012A和9012B之间序列差异开发的新标记在20,391个单株的分离群体中与ms3基因共分离。和原来的定位结果相比,虽然开发了新的标记,但并没有缩小包含ms3基因的物理区间。4.根据白菜和甘蓝的序列差异,开发出在49份白菜和8份甘蓝之间存在稳定多态性的共显性标记2个。利用该标记筛选先前鉴定的甘蓝型油菜BAC克隆文库,发现标记在克隆中扩增产物与白菜基因组中大小和序列一致,而没有发现与甘蓝基因组中大小一致的克隆。而根据先前的研究,ms3基因定位于N19连锁群,对应甘蓝的第9染色体。据此推测,筛选到的BAC克隆事实上可能是ms3基因位于白菜基因组中的同源区。5.利用BAC克隆开发出的SSR标记和本实验中开发的A、C基因组特异标记DM1在Ms4定位群体中进行多态性检测,发现所有标记在定位群体中与Ms4基因不连锁,暗示着Ms4基因可能根本就不是Ms3的一个同源基因,而是两个起源不同的基因。因此,以前认为Ms3和Ms4为重叠隐性基因的这一说法可能需要进一步论证。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表  11-12
1 文献综述  12-28
  1.1 比较基因组学  12
  1.2 比较基因组学研究方法  12-13
  1.3 比较基因组学的用途  13-15
    1.3.1 比较基因组学在物种进化和分类中的应用  13-14
    1.3.2 比较基因组学在基因定位、克隆中的应用  14
    1.3.3 在遗传研究和作物改良中的应用  14
    1.3.4 非编码区结构和功能研究  14-15
    1.3.5 通过比较基因组学方法推测未知基因功能  15
  1.4 比较基因组学研究方法芸薹属中的应用  15-24
    1.4.1 芸薹属概况  15-16
    1.4.2 比较基因组学在芸薹属基本种基因组中的研究应用  16-17
    1.4.3 比较基因组学在芸薹属复合种基因组研究中的应用  17-18
    1.4.4 拟南芥信息在芸薹属植物比较基因组学研究中的应用  18-21
      1.4.4.1 拟南芥应用于芸薹属基因组信息比较及进化过程的研究  19-20
      1.4.4.2 拟南芥信息在芸薹属遗传图谱构建中的应用  20-21
    1.4.5 芸薹属植物微观共线性研究  21-24
      1.4.5.1 基于物理作图的比较研究  21-22
      1.4.5.2 基于测序技术的序列比较  22-24
  1.5 分子标记  24-28
    1.5.1 分子标记的分类及常用分子标记  25
    1.5.2 常用几种分子标记介绍  25-26
    1.5.3 分子标记的开发  26-28
2 研究目的和意义  28-29
3 材料和方法  29-35
  3.1 实验材料  29
  3.2 DNA的提取  29
  3.3 BAC质粒DNA的提取  29-30
  3.4 引物设计  30
  3.5 PCR反应体系、反应程序  30
  3.6 PCR反应产物的电泳检测  30-32
    3.6.1 琼脂糖凝胶电泳检测及回收程序  30-31
    3.6.2 垂直胶检测程序  31-32
  3.7 热激感受态细胞的制备  32
  3.8 目标片段与载体的连接及转化  32-35
    3.8.1 克隆反应体系的建立  32-33
    3.8.2 转化及克隆检测  33-34
    3.8.3 克隆片段的测序和序列分析  34-35
4.结果与分析  35-50
  4.1 本实验已有的研究基础  35
  4.2 目标区域引物设计及扩增  35-36
  4.3 测序结果在甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中的比较分析  36-42
    4.3.1 测序结果拼接  36
    4.3.2 4个材料中相同区段序列的初步比对  36-37
    4.3.3 白菜、甘蓝和甘蓝型油菜在目标区段与Tapidor21的比较  37-39
    4.3.4 连续区段的序列结构分析  39-42
      4.3.4.1 整体序列结构分析  39
      4.3.4.2 基因区域m在甘蓝型油菜和白菜、甘蓝基因组中的分析  39-40
      4.3.4.3 基因区域n在甘蓝型油菜中和A、C基因组中的分析  40-42
  4.4 序列进化分析  42-43
  4.5 与Ms3紧密连锁分子标记的进一步开发  43-45
  4.6 白菜、甘蓝基因组同源区的多态性标记开发  45-47
  4.7 多态性标记在BAC文库中的检测及在TN连锁图上的定位  47-49
  4.8 Ms3连锁标记在Ms4位点分离材料中筛选  49-50
5 讨论与分析  50-55
  5.1 目标区域的测序  50-51
  5.2 包含Ms3的染色体片段在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的保守性分析  51-52
  5.3 甘蓝型油菜中比较测序开发多态性标记的难度  52-53
  5.4 基于A、C基因组多态性标记对BAC克隆的鉴定  53-55
参考文献  55-65
附录  65-67
致谢  67

油菜隐性细胞核雄性不育基因区段的比较分析与特异标记的开发

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