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植酸酶高效生产菌株74~#的改良

作　者: 唐辉桂
导　师: 姚斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 植酸酶 二硫键异构酶 乙醇脱氢酶启动子 透明颤菌血红蛋白 α凝集素蛋白 毕赤酵母
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


植酸酶是一种可以水解植酸的磷酸酶类,能够分解饲料中的植酸为动物可利用的无机磷和肌醇,已经在动物营养,人类营养以及酶法合成低磷酸肌醇方面有了很广的应用范围。但目前,提高植酸酶生产菌株的单位表达量,进一步降低其生产成本仍然是最重要的植酸酶产业目标之一。本研究以目前植酸酶表达量最高的实际生产菌株74#为材料,通过共表达二硫键异构酶、透明颤菌血红蛋白,增加基因拷贝数等方法,以期进一步提高其表达量,降低生产成本。本研究也对毕赤酵母表面展示植酸酶进行了尝试。根据已发表的毕赤酵母来源二硫键异构酶(PDI)基因序列,克隆获得PDI编码基因,并构建了含有PDI编码基因的毕赤酵母胞内表达载体pPICZA-pdi,以植酸酶生产菌株74#为受体进行了转化。从600个转化子中筛选到3个酶活性更高的重组子,其中酶活性最高的49#菌株其活性是原有菌株74#酶活性的120%,在5L发酵罐中表达活性达到16,582 U/mL。在此基础上,用经密码子优化的大肠杆菌植酸酶基因appA-m,构建了表达载体pPIC9K-appA-m。以共表达PDI蛋白的植酸酶菌株49#为受体,筛选重组子后得到多拷贝的植酸酶菌株79#,酶活性达到17,434 U/mL,与共表达PDI蛋白的49#菌株相比,提高了10%;与生产菌株74#相比,提高了34%。根据已发表的树干毕赤酵母基因组序列克隆了低氧启动子PsADH2 promoter序列,并根据已发表的透明颤菌血红蛋白序列,按照毕赤酵母密码子偏爱性对血红蛋白基因进行了密码子改造和合成。构建了表达载体pPIC9K-PsADH2-vgb-m,以植酸酶生产菌株74#为受体进行了转化。对重组子进行筛选得到低氧条件下植酸酶活性最高的转化子15#,利用摇瓶培养,其在低氧条件下的酶活性是74#菌株酶活性的4倍,达到249 U/mL。另外,本研究对表面展示植酸酶进行了尝试。通过已发表的啤酒酵母基因组序列克隆了α凝集素蛋白AGα1编码基因,构建了表达载体pPIC9K-appA-m-AGα1,转化毕赤酵母,对重组子进行筛选,得到了在酵母细胞表面有植酸酶活性的菌株。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-10
第一章 绪论  10-25
  1.1 毕赤酵母表达系统研究进展  10-21
    1.1.1 甲醇代谢途径  10-11
    1.1.2 表达系统的组成  11-17
    1.1.3 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素  17-20
    1.1.4 蛋白质二硫键异构酶PDI 的作用  20
    1.1.5 透明颤菌血红蛋白(VHb)的作用  20-21
  1.2 重组植酸酶的研究进展  21-24
    1.2.1 植酸酶来源和分类  21-22
    1.2.2 大肠杆菌来源的植酸酶基因  22
    1.2.3 植酸酶基因工程  22-23
    1.2.4 植酸酶的应用  23-24
  1.3 本论文研究目的和意义  24-25
第二章 共表达蛋白质二硫键异构酶对重组酵母中植酸酶 AppA 表达的影响  25-36
  2.1 材料与方法  25-31
    2.1.1 材料  25-26
    2.1.2 方法  26-31
  2.2 结果与分析  31-35
    2.2.1 PDI 编码基因的克隆与分析  31
    2.2.2 重组表达载体pPICZA-pdi 的构建及酶切鉴定  31
    2.2.3 重组酵母的获得及筛选  31-33
    2.2.4 发酵罐水平植酸酶的表达  33
    2.2.5 重组酵母中appA-m, pdi 基因的PCR 检测分析  33-34
    2.2.6 重组酵母菌株中二硫键异构酶PDI 的Western blot 分析  34
    2.2.7 PDI 共表达对重组酵母菌体生长的影响  34-35
  2.3 本章小结  35
  2.4 讨论  35-36
第三章 增加植酸酶 AppA 基因的拷贝数对其表达的影响  36-40
  3.1 材料与方法  36-37
    3.1.1 材料  36
    3.1.2 方法  36-37
  3.2 结果与分析  37-39
    3.2.1 酵母表达载体的构建  37-38
    3.2.2 重组酵母的获得与筛选  38
    3.2.3 重组菌株在发酵罐水平的表达研究  38-39
  3.3 本章小结  39
  3.4 讨论  39-40
第四章 共表达透明颤菌血红蛋白(VHb)对重组酵母中植酸酶 AppA 表达的影响  40-48
  4.1 材料与方法  40-43
    4.1.1 材料  40-41
    4.1.2 方法  41-43
  4.2 结果  43-46
    4.2.1 血红蛋白基因的合成  43-44
    4.2.2 低氧启动子的克隆及表达载体的构建  44
    4.2.3 重组酵母的获得和筛选  44-45
    4.2.4 重组酵母中appA, vgb 基因的PCR 检测分析  45
    4.2.5 酵母菌株中血红蛋白VHb 的Western blot 分析  45-46
    4.2.6 VHb 共表达对重组酵母菌株生长的影响  46
  4.3 本章小结  46
  4.4 讨论  46-48
第五章 植酸酶appA-m 基因在 Pichia pastoris 细胞上的表面展示  48-55
  5.1 材料与方法  48-50
    5.1.1 材料  48
    5.1.2 方法  48-50
  5.2 结果与分析  50-53
    5.2.1 AGα1 基因的克隆  50-51
    5.2.2 植酸酶基因appA-m 表面展示载体的构建  51-52
    5.2.3 重组酵母的获得及筛选  52
    5.2.4 表面展示植酸酶AppA 的酶学性质测定  52-53
  5.3 本章小结  53-54
  5.4 讨论  54-55
第六章 全文结论  55-56
参考文献  56-66
致谢  66-67
作者简历  67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 饲料
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