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基于重组PfLDH靶点的抗疟中药快速筛选及疟疾现场诊断

作　者: 徐小玲
导　师: 曾庆平
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中医临床基础
关键词: 恶性疟原虫乳酸脱氢酶可溶性表达抑制剂高通量筛选诊断试剂盒
分类号: R531.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病,也是世界上除艾滋病以外病例明显上升的传染病,全球每年因罹患疟疾而死亡的人数高达300万。恶性疟原虫对目前所使用的抗疟药产生耐药性对于疟疾流行区来说是一个潜在的巨大灾难,而多靶点抗疟对于避免和延缓抗药性的产生是至关重要的。在当今抗药性疟疾流行的严峻形势下,寻求作用于新靶点的抗疟药势在必行。疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)为疟原虫体内产能所必需的代谢酶,它在疟原虫的整个红内期均表达,是抗疟药作用的理想靶点之一。pLDH能迅速利用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD)作为辅酶参与原虫无氧酵解,从而产生三磷酸腺苷(ATP),为疟原虫的生存提供能量。对于厌氧的疟原虫来说,pLDH是其生长与繁殖所必需的。因此,能够抑制疟原虫乳酸脱氢酶活性的化合物也能够杀死疟原虫,这就为利用pLDH作为新靶点筛选抗疟新药前体提供了可能。为了构建高通量筛选及体外评价代谢酶靶点抑制剂的平台用于抗疟新药开发,本研究采用聚合酶链反应(PCR)扩增恶性疟原虫海南株FCC/HN的LDH基因(PfLDH)并克隆到pTARCET载体中测定全序列,测序结果已由GenBank收录(注册编号DQ825436)。经BLAST检索,本次克隆FCC/HN株的PfLDH基因与K1株PfLDH基因的同源性高达99.79%。为了获得大量可溶性PfLDH,本研究分别利用融合表达载体pGEX-2TK和pET-29a(+)将PfLDH基因导入大肠杆菌BL21和BL21(DE3)菌株中高效表达。结果表明,由pGEX/PfLDH产生的PfLDH融合蛋白主要以包涵体状态存在,而以pET-29a(+)为载体表达PfLDH基因则形成大量可溶性PfLDH,表明后者更适合于PfLDH基因表达。用亲和层析柱纯化的PfLDH重组蛋白包被96孔板,分别加入常山、葛根、砂仁、虎杖等4味中药的粗提物,对其中所含PfLDH活性抑制成分进行体外筛选。结果发现,除常山外,其余3种中药提取物均对PfLDH显示强烈抑制作用。将上述中药粗提物添加到抗疟药微量评价系统中,进一步观察了它们对疟原虫生长的影响。结果表明,除虎杖因技术原因未能检测外,常山和葛根能显著阻遏疟原虫的生长,而砂仁不能抑制疟原虫生长。因此,葛根粗提物既是PfLDH活性抑制剂,又是疟原虫生长阻遏物。对葛根粗提物的进一步有机溶剂萃取及PfLDH活性测定结果表明,水层、正丁醇部位及冰醋酸部位均显示较强抑制作用,乙醇部位抑制作用较弱,而乙酸乙酯部位无明显抑制作用。另一方面,本研究还利用所获得的重组PfLDH作为抗原制备抗PfLDH的多克隆抗体,初步研制出疟疾快速诊断试剂盒,并在培养的虫血上清及疟疾患者血样中检测到PfLDH。本研究构建的抗疟中药筛选及疟疾诊断平台具有较大的应用价值,并具有低价、高效和灵敏等优点,值得进一步研发。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
引言  10-12
第一章文献综述  12-19
  一、目前所用抗疟药物作用机制  12-14
    (一)青蒿素类药物的抗疟机制  12-13
    (二)喹啉类药物的抗疟机制  13-14
  二、疟原虫蛋白及其应用  14-15
    (一)作为传播阻断疫苗靶抗原的疟原虫蛋白  14
    (二)疟原虫相对特异的作为疟疾诊断靶点的蛋白  14-15
    (三)作为药物作用靶点的疟原虫蛋白  15
  三、pLDH的特性  15-17
  四、pLDH在疟疾诊断中的应用  17-18
  五、pLDH抑制剂的研究概况  18-19
第二章 PfLDH基因的克隆与测序  19-26
  一、材料和试剂  19-20
    (一)虫株:恶性疟原虫海南株FCC1/HN由本所疟疾室提供。  19
    (二)菌株与质粒  19
    (三)主要试剂  19
    (四)主要仪器  19-20
  二、实验方法  20-23
    (一)引物设计  20
    (二)恶性疟原虫基因组DNA的提取  20
    (三)PCR扩增  20-21
    (四)目的片段的克隆  21-23
  三、结果  23-24
    (一)PfLDH基因的扩增  23
    (二)重组质粒的酶切鉴定  23-24
    (三)PfLDH的DNA序列分析  24
  四、讨论  24-26
第三章 PfLDH基因在大肠杆菌中的表达及纯化  26-41
  一、材料和试剂  26
    (一)菌株与质粒  26
    (二)主要试剂  26
  二、实验方法  26-33
    (一)融合表达载体pGEX/PfLDH的构建  27-28
    (二)融合蛋白的诱导表达  28
    (三)融合蛋白的SDS-PAGE检测  28-30
    (四)融合蛋白的Westernblotting检测  30-31
    (五)目的蛋白的纯化  31-33
  三、结果  33-39
    (一)融合表达载体pGEX/PfLDH的构建  33-34
    (二)融合蛋白的SDS-PAGE检测  34-35
    (三)融合蛋白的Westernblotting检测  35-36
    (四)表达的目的蛋白的纯化  36-39
  四、讨论  39-41
第四章 PfLDH基因表达产物的免疫学及酶学活性测定  41-47
  一、材料  41
  二、实验方法  41-43
    (一)抗PfLDH多克隆抗体的制备  41-42
    (二)ELASA测定  42
    (三)Western blotting检测  42
    (四)PfLDH的酶学活性测定  42-43
  三、结果  43-45
    (一)PfLDH的免疫学活性测定  43-44
    (二)PfLDH的酶学活性测定  44-45
  四、讨论  45-47
第五章中药提取物对PfLDH酶活性的抑制  47-53
  一、材料和试剂  47
  二、实验方法  47-49
    (一)基于96孔板的筛选平台  47
    (二)对PfLDH具有抑制作用的重要成分筛选  47-49
  三、结果  49-51
    (一)高通量筛选平台的建立  49-50
    (二)中药粗提物对重组PfLDH蛋白的抑制作用  50-51
    (三)葛根各部位对重组PfLDH蛋白的抑制作用  51
  四、讨论  51-53
第六章 PfLDH抑制性中药成分体外抗疟效果评价与疟疾感染状况检测  53-58
  一、材料和试剂  53
  二、实验方法  53-55
    (一)疟原虫对中药提取物的体外敏感试验  53
    (二)斑点免疫酶渗滤法检测  53-55
  三、结果  55-56
    (一)疟原虫对中药提取物的体外敏感试验  55
    (二)疟疾感染状况检测  55-56
  四、讨论  56-58
结语  58-59
参考文献  59-63
附录  63-69
致谢  69

基于重组PfLDH靶点的抗疟中药快速筛选及疟疾现场诊断

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