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反胶束体系在酶法测定和生物分离中的应用研究

作　者: 何进星
导　师: 柳畅先
学　校: 中南民族大学
专　业: 分析化学
关键词: 反胶束固定化酶法测定醇脱氢酶乳酸脱氢酶酶催化动力学萃取生物分离
分类号: O648
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的与正常胶束结构相反的一种含水聚合体。由于反胶束体系能较好地模拟酶的天然环境,因而大多数酶能保持催化活性和稳定性。反胶束酶系统在生物反应中的催化作用研究取得了较大进展,众多实验室对该体系中酶的定位和结构、酶的动力学特征、催化活性和稳定性等方面的理论研究,为进一步拓宽反胶束技术的应用领域打下了良好基础。当含反胶束的有机溶剂和蛋白质水溶液接触时,蛋白质在几种作用力(静电、亲和、疏水)的协同作用下进入极性核中,然后再调节适当的条件,使蛋白质从负载有机相重新反萃取到水相中,以达到纯化的目的。反胶束萃取是一种溶剂萃取,具有样品处理量大、容易放大和可连续操作的特点,反胶束内的环境接近细胞内的环境,蛋白质不易变性。反胶束萃取还具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高的优点。因此,反胶束萃取技术为蛋白质的分离纯化开辟了一条具有工业开发前景的新途径。第一章概述了酶分析法和反胶束技术的基本理论和应用。第二章研究了反胶束溶液中乳酸脱氢酶(LDH)的催化动力学性质,试验了含水量、表面活性剂和助溶剂用量对酶进入反胶束的影响。讨论了温度、pH等因素对酶活力的影响,并考察了LDH的荧光光谱。第三章研究了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)-辛烷-己醇反胶束体系固定化醇脱氢酶(ADH)的制备及应用。考察了含水量、CTAB和正己醇用量对于ADH固定化的影响。对游离酶和固定化酶的催化动力学性质研究表明:酶促反应的最适pH值分别为8.2和8.8,最适温度分别为31℃和20℃,对乙醇的米氏常数Km分别为12 mmol/L和7.4 mmol/L。30℃时,游离酶存放150 min后失活90%,固定化酶失活50%,表明反胶束固定化ADH有较好的热稳定性。并应用此体系测定了试样中乙醇的含量。第四章探讨了反胶束体系萃取酵母ADH,在此萃取体系中,以CTAB作为表面活性剂,异辛烷和戊醇作为溶剂和助溶剂。试验了表面活性剂及助溶剂浓度、初始水相pH值对萃取的影响。详细讨论了反萃水相离子强度、异丙醇浓度对反萃的影响,确立了最佳提取条件。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-21
  1.1 酶分析法概述  12-13
  1.2 生物大分子分离纯化方法概述  13-14
    1.2.1 沉淀法  13
    1.2.2 层析法  13
    1.2.3 电泳法  13-14
    1.2.4 溶剂萃取法  14
  1.3 反胶束简介  14-20
    1.3.1 反胶束溶液中的酶催化动力学性质  15-17
    1.3.2 反胶束萃取生物活性物质  17-20
  1.4 本论文的研究意义  20
  1.5 本论文研究的主要内容  20-21
第二章乳酸脱氢酶在反胶束溶液中的催化动力学性质  21-29
  2.1 引言  21
  2.2 实验部分  21-22
    2.2.1 仪器与试剂  21
    2.2.2 实验方法  21-22
  2.3 结果与讨论  22-28
    2.3.1 固定化条件  22-24
      2.3.1.1 反胶束含水量对酶固定化的影响  22
      2.3.1.2 CTAB浓度对酶固定化的影响  22
      2.3.1.3 正戊醇浓度对酶固定化的影响  22-24
    2.3.2 酶催化动力学性质  24-28
      2.3.2.1 pH 值和温度对酶活力的影响  24-26
      2.3.2.2 LDH 的热稳定性  26
      2.3.2.3 LDH 的荧光光谱  26
      2.3.2.4 米氏常数 K_m的测定  26-28
  2.4 结论  28-29
第三章反胶束固定化醇脱氢酶的制备及应用  29-38
  3.1 引言  29
  3.2 实验部分  29-30
    3.2.1 仪器及试剂  29
    3.2.2 实验方法  29-30
      3.2.2.1 反胶束固定化 ADH 的制备  29
      3.2.2.2 酶活力及乙醇浓度的测定  29-30
  3.3 结果与讨论  30-38
    3.3.1 固定化条件  30-32
      3.3.1.1 反胶束含水量对酶固定化的影响  30
      3.3.1.2 CTAB 浓度对酶固定化的影响  30
      3.3.1.3 正己醇浓度对酶固定化的影响  30-32
    3.3.2 酶催化动力学性质  32-37
      3.3.2.1 pH 值和温度对酶活力的影响  32-34
      3.3.2.2 镉离子存在下的 ADH 动力学反应  34
      3.3.2.3 ADH 的荧光光谱  34-35
      3.3.2.4 米氏常数 Km 的测定  35
      3.3.2.5 ADH 的热稳定性  35-37
    3.3.3 反胶束体系用于试样的测定  37-38
      3.3.3.1 共存组分的影响  37
      3.3.3.2 标准曲线  37
      3.3.3.3 试样测定和加标回收试验  37-38
第四章反胶束体系分离纯化醇脱氢酶  38-45
  4.1 引言  38
  4.2 实验部分  38-39
    4.2.1 仪器及试剂  38
    4.2.2 实验方法  38-39
      4.2.2.1 萃取和反向萃取  38-39
      4.2.2.2 蛋白质浓度的测定  39
      4.2.2.3 ADH 活力的测定  39
  4.3 结果与讨论  39-44
    4.3.1 正萃条件试验  39-41
      4.3.1.1 CTAB 浓度的影响  39
      4.3.1.2 正戊醇浓度的影响  39-41
      4.3.1.3 初始水相pH 的影响  41
    4.3.2 反萃条件试验  41-44
      4.3.2.1 反萃水相中离子强度的影响  41-42
      4.3.3.2 异丙醇在反萃水相中浓度的影响  42
      4.3.3.3 反萃水相pH 的影响  42-44
  4.4 结论  44-45
全文总结  45-46
参考文献  46-54
致谢  54-55
附录A 攻读硕士学位期间发表的论文  55

反胶束体系在酶法测定和生物分离中的应用研究

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