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截短型rBTI的表达、纯化及性质研究

作 者: 李静舒
导 师: 王转花
学 校: 山西大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 截短型突变体 理化性质 抗肿瘤
分类号: R284.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor, PI)是一类可以作用于蛋白酶,并对其有抑制活性的小分子肽或者蛋白质。蛋白酶抑制剂广泛分布在自然界中,以多种形式存在于动物、植物和微生物体内。有机体中许多重要的生理学过程都需要依赖蛋白酶抑制剂对蛋白酶精确的调控作用来正常进行。根据抑制剂作用于蛋白酶的活性位点,可以将蛋白酶抑制剂分为五类:丝氨酸蛋白酶抑制剂,苏氨酸蛋白酶抑制剂,半胱氨酸蛋白酶抑制剂,天冬氨酸蛋白酶抑制剂以及金属蛋白酶抑制剂。研究人员对丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构、作用机理以及生物学活性等方面的研究较为深入。胰蛋白酶抑制剂(Trypsin Inhibitor, TI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。植物来源TI的多样性以及丰富性使得它们成为了研发具有药理学特性的新蛋白类药物的资源。荞麦(Fagopyrum esculentum Moench.)属蓼科植物,作为一种药食同源作物,它含有丰富的蛋白质、矿物质以及黄酮类物质。本实验室先前通过基因工程技术获得一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant Buckwheat Trypsin Inhibitor, rBTI),该抑制剂能够专一性的抑制胰蛋白酶的活性。通过氨基酸定点突变确定Arg45为rBTI的活性区域氨基酸,X-射线晶体衍射实验显示,在69个氨基酸组成的rBTI分子结构中含有一段α-螺旋和两端p-折叠,其余为线性区域。功能分析表明,该抑制剂具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。为了揭示rBTI的结构与功能的关系,本研究根据rBTI的氨基酸序列及分子结构,将其C-端区的VVM, TPVVM, VDTPVVM分别进行截短,构建了3个截短型重组质粒pExsecI-rBTI-t1、pExsecI-rBTI-t2和pExsecI-rBTI-t3,并实现在大肠杆菌BL21中的可溶性表达。通过ResourceQ阴离子交换层析和Superdex75分子筛层析分离纯化,目的蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶图谱中显示单一条带,纯度高达98%以上。胰蛋白酶抑制活性实验结果显示,与野生型rBTI相比,截短型rBTI仍具有较强的胰蛋白酶抑制活性,可能是由于C-末端氨基酸的缺失并没有影响到rBTI活性中心和必须基团氨基酸的改变,所以保留了较为完整的胰蛋白酶抑制活性。理化性质分析结果显示,3个截短型rBTI均具有良好的酸碱稳定性及热稳定性,在pH2.0-10.0的范围内和高温处理60min后,仍具有较强的胰蛋白酶抑制活性。圆二色光谱分析结果进一步证实这3个截短型突变体的二级结构没有发生明显变化。体外抗肿瘤实验及细胞核形态观察结果显示,截短型rBTI对EC9706(人食管癌细胞)具有一定的生长抑制作用,并呈剂量依赖性。本研究采用截短突变技术,通过原核系统表达和两步分离纯化获得了3个截短型抑制剂rBTI-t1、rBTI-t2和rBTI-t3。理化性质和体外肿瘤实验结果提示,rBTI C-末端氨基酸的缺失并未引起其活性区域或功能部位的较大改变。表明C-末端63-69的氨基酸对于抑制剂与蛋白酶的结合没有必然的关系。这些结果为深入开展rBTI结构与功能的关系以及作用机理的研究提供了方法和新的思路。

全文目录


摘要  10-12ABSTRACT  12-14第一章 文献综述  14-22  1.1 引言  14  1.2 蛋白酶抑制剂概述  14-19    1.2.1 蛋白酶抑制剂的分类  14    1.2.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂  14-15    1.2.3 胰蛋白酶抑制剂  15-16    1.2.4 蛋白酶抑制剂的研究和应用  16-19  1.3 植物蛋白酶抑制剂的概述  19-21    1.3.1 植物蛋白酶抑制剂  19-20    1.3.2 荞麦蛋白酶抑制剂  20-21  1.4 论文设计思路  21-22    1.4.1 论文研究背景  21    1.4.2 论文研究目的及意义  21-22第二章 截短型rBTI的表达、纯化及抑制活性分析  22-32  2.1 引言  22  2.2 实验材料  22-23    2.2.1 质粒和菌株  22    2.2.2 主要生化试剂及酶  22-23    2.2.3 主要实验仪器  23  2.3 实验方法  23-27    2.3.1 rBTI氨基酸序列分析  23-24    2.3.2 截短的依据  24-25    2.3.3 截短型rBTI表达载体的构建  25-26    2.3.4 截短型rBTI的表达、纯化  26    2.3.5 截短型rBTI的胰蛋白酶抑制活性分析  26-27  2.4 实验结果  27-30    2.4.1 截短型rBTI表达质粒的构建  27    2.4.2 截短型rBTI的表达、纯化  27-30    2.4.3 截短型rBTI的蛋白酶抑制活性测定  30  2.5 讨论  30-32第三章 截短型rBTI和野生型rBTI的理化性质比较  32-41  3.1 引言  32-33  3.2 实验材料  33    3.2.1 实验试剂  33    3.2.2 实验仪器  33  3.3 实验方法  33-34    3.3.1 胰蛋白酶抑制作用的动力学  33-34    3.3.2 抑制剂的稳定性分析  34    3.3.3 抑制剂的圆二色光谱分析  34  3.4 实验结果  34-39    3.4.1 截短型rBTI和野生型rBTI的动力学分析  34-36    3.4.2 抑制剂稳定性比较分析  36-38    3.4.3 圆二色光谱比较分析  38-39  3.5 讨论  39-41第四章 截短型rBTI抑制肿瘤细胞增殖的初步研究  41-46  4.1 引言  41-42  4.2 实验材料  42    4.2.1 细胞株和实验试剂  42    4.2.2 实验仪器  42  4.3 实验方法  42-43    4.3.1 细胞培养  42    4.3.2 截短型rBTI和野生型rBTI对EC9706细胞增殖抑制作用的MTT检测  42-43    4.3.3 EC9706细胞核形态学分析  43  4.4 实验结果  43-44    4.4.1 截短型rBTI和野生型rBTI对EC 9706细胞生长的影响  43-44    4.4.2 细胞核形态学分析  44  4.5 讨论  44-46参考文献  46-54总结与展望  54-55攻读学位期间取得的研究成果  55-56致谢  56-57个人简况及联系方式  57-59

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学 > 化学分析与鉴定
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