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ELISA快速检测艾滋病人血中马尔尼菲青霉菌感染

作　者: 秦雯
导　师: 马韵
学　校: 广西医科大学
专　业: 病理学
关键词: 马尔尼菲青霉菌酶标抗体酶联免疫吸附实验免疫组织化学免疫斑点
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

背景和目的马尔尼菲青霉菌（Penicillium marneffei,P.m）是艾滋病患者常易感染的一种机会性致病真菌,为青霉属中唯一的温度依赖性双相菌种。由其所致的马尔尼菲青霉病（Penicilliosis marneffei,PSM）是我国南方以及东南亚国家艾滋病人的常见死因。诊断马尔尼菲青霉病主要依靠真菌培养及组织病理检查;但前者常使时间延误,后者有时易和其它巨噬细胞内病原体混淆。而一些新兴的分子检测方法如聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）、基因芯片等又由于种种原因目前尚不能在临床上推广使用,因此建立简捷而敏感的检测方法成为防治马尔尼菲青霉病迫切需要解决的关键问题之一。为此,本研究利用前期已经制备好的P.m特异性抗体,通过建立酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）快速检测血清中马尔尼菲青霉菌抗原,以提高临床诊断效率。方法（1）本课题组前期与上海国家人类基因组南方研究中心合作已对P.m的功能基因组学进行了研究。通过cDNA文库的构建和分析,发现了P.m的两条可能编码细胞壁蛋白的特异性新基因PYA₀24₆0和PYA₀12₉2,用这两条基因经大肠杆菌表达的蛋白免疫新西兰兔产生特异性多克隆抗体,其中PYA₀12₉2抗体特异性较高,用于本实验的研究。（2）从档案中选取23例经临床和病理检查证实为马尔尼菲青霉感染病例,以及23例杂菌（其中曲菌14例、白色念珠菌2例、新型隐球菌2例、毛霉菌2例、放线菌3例）感染病例的石蜡标本进行连续切片,分别进行苏木素-伊红（hematoxvlin and eosin,HE）染色、过碘酸-雪夫氏（Periodic Acid Schiff,PAS）染色以及经淀粉酶消化后的PAS染色（D-PAS）,并用前述兔抗马尔尼菲青霉抗体对上述组织切片进行免疫组化染色,以检验该抗体的特异性和粗步确定抗体效价;（3）采用过碘酸钠法,给该抗体标记上辣根过氧化物酶并进行纯化,用纯化后的酶标抗体与马尔尼菲青霉病人血清做免疫琼脂双向扩散实验,验证酶标抗体的活性。（4）用特异性马尔尼菲青霉抗体包被硝酸纤维膜,通过免疫斑点法对经真菌培养确诊的艾滋病继发马尔尼菲青霉病人血清标本进行检测,以摸索与之原理相同的ELISA法的实验条件。（5）用特异性马尔尼菲青霉抗体包被聚苯乙烯板,运用ELISA双抗夹心法检测103例艾滋病血清标本中马尔尼菲青霉抗原并与免疫斑点法的检测结果进行比较。结果（1）组织学和免疫组织化学结果:23例马尔尼菲青霉病例的基础疾病均为艾滋病,可见淋巴结内淋巴细胞衰减,巨噬细胞大量增生,特殊染色可见酵母型真菌大量聚集于巨噬细胞胞质内,也有部分真菌在巨噬细胞外;在油镜下观察可见P.m特征性的腊肠状菌体和细胞内横隔。免疫组化结果显示,本实验室前期制备的抗体能使其中22例马尔尼菲青霉病组织切片里的P.m显棕黄色,阳性部位主要在细胞壁,但胞浆也有轻度着色;而其它几种真菌和放线菌则呈阴性,这说明抗体具有很高的特异性。（2）酶标抗体的质量和活性:辣根过氧化物酶与抗体的克分子比值为1.594（大于1.5）,酶与抗体的结合率为37.25%（大于30%）,质量较好;免疫双扩散检测酶标抗体有较好的抗体活性和酶活性。（3）免疫斑点法实验条件的确立:经方阵法测得免疫斑点法中包被抗体的浓度为40μg/ml、待测血清的稀释度为1:1、酶标抗体的浓度为1:40。（4）ELISA实验条件的确立:经方阵法测得ELISA中包被抗体的浓度为20μg/ml、待测血清的稀释度为1:2、酶标抗体的浓度为1:20。（5）用免疫斑点法和ELISA法分别检测103例AIDS患者病人血清,两者马尔尼菲青霉抗原检测阳性率与金标准（真菌培养）的差别无显著意义;前者的灵敏度与符合率分别为75%和97.09%,后者的灵敏度与符合率分别87.5%和98.06%,ELISA优于免疫斑点法。结论:1、用ELISA方法检测患者血清中的马尔尼菲青霉抗原较传统的真菌培养法更为快速、简便,适用于临床大量标本的检测,易在基层医院推广使用。2、建立了双抗夹心ELISA检测血清中马尔尼菲青霉抗原的定性方法,为后续的定量检测和双抗夹心ELISA检测马尔尼菲青霉病试剂盒的制作奠定基础。

全文目录

一、论文  4-40
  1. 缩略词表  4-5
  2. 中文摘要  5-7
  3. 英文摘要  7-9
  4. 前言  9-10
  5. 实验材料  10-13
  6. 实验方法  13-19
  7. 结果  19-27
  8. 讨论  27-36
  9. 结论  36-37
  10. 参考文献  37-40
二、综述一  40-51
  1. 正文  40-46
  2. 参考文献  46-51
三、综述二  51-60
  1. 正文  51-57
  2. 参考文献  57-60
致谢  60

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