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产碱性纤维素酶高产菌株IS-B4的选育、发酵条件优化与酶学性质的研究

作　者: 肖黎明
导　师: 王卫卫
学　校: 西北大学
专　业: 微生物学
关键词: 碱性纤维素酶嗜碱性软化芽孢杆菌诱变育种发酵条件优化酶学性质
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

碱性纤维素酶（Alkaline Cellulase,简称CMCase）是纤维素酶系的一个组分。碱性纤维素酶主要是与棉纤维中10%左右的非结晶区（无定形区）的纤维素分子起作用,对结晶区纤维素水解活力很低,所以并不会明显降低棉纤维的牢固度,因而广泛用于洗涤剂中。这种酶制剂来源于天然,易于生物降解,少量使用即获明显效果,对环境又无不良影响,是目前世界洗涤工业发展的趋势,除此之外,在食品、化工、造纸、麻纺、环境保护等领域均有重要作用,这使得CMCase的生产研究具有重大意义。本文通过多因子复合诱变,获得一稳定高产碱性纤维素酶菌株IS-B4;在此基础上优化了该菌株的摇瓶产酶条件及5L发酵罐发酵条件,并研究了菌株IS-B4所产的CMCase的一些酶学性质,结果分述如下:1.以实验室保藏的一株嗜碱性软化芽孢杆菌（Bacillus.macerans）IS-B为研究对象,首先对菌体形态和生理生化特征进行了研究,其产CMC酶活力为10.2U/mL,做为后续诱变的出发菌株。采用紫外线（UV）、硫酸二乙酯（DES）、He-Ne激光及紫外+硫酸二乙酯复合诱变对菌株IS-B进行处理:紫外线照射40 s、硫酸二乙酯诱变10 min、He-Ne激光辐射20 min以及紫外线照射40 s与20 min硫酸二乙酯复合处理分别是最佳诱变剂量,结合平板快速筛选方法以及突变株产酶性能稳定性的分析,得到突变株IS-B4,产酶活力为52.3U/mL,是出发菌株产酶活力的5.13倍。2.经碳、氮源、金属离子和磷酸盐筛选试验和正交设计试验,确定菌株IS-B4产酶的最佳培养基配方为（w%）:蔗糖2%,酵母膏2%,NaCl 0.5%,KH₂PO₄0.1%。最适产酶的培养条件为:培养温度为36℃,pH 9.0,接种量5%,发酵培养基的250 mL三角瓶装液量为60 mL:在得到的最佳产酶条件下二级摇瓶发酵产酶活力为56.0 U/mL。3.在5 L罐发酵罐中,研究了菌株IS-B4的发酵规律,通过改善菌体快速增长时期的氧供应不足状况,可缩短菌体生长到达稳定期的时间,菌体产酶时间也能相应的提前。最终菌株IS-B4在5 L罐发酵罐中发酵16 h产CMC酶活力达59.8 U/mL。4.对菌株IS-B4所产CMCase的一些性质进行了研究,此酶反应的最适温度为36℃,最适pH值为9.0～10.0,在pH 7.0～10.0范围内基本稳定,在30～70℃基本保-持稳定;酶的活性受金属离子和一些化合物的影响,Zn²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺对酶活有明显的抑制作用,Na⁺、Ca²⁺对酶活力有促进作用。表面活性剂Tween 80对酶活性影响不大。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章文献综述  10-22
  1.碱性纤维素酶的研究概况  10-22
    1.1 产碱性纤维素酶的微生物  10-11
    1.2 碱性纤维素酶产生菌的分离方法  11-12
    1.3 碱性纤维素酶产生菌的筛选与培养条件研究  12-15
    1.4 碱性纤维素酶的特点  15-16
    1.5 碱性纤维素酶的作用机理  16-18
    1.6 碱性纤维素酶酶学性质的研究  18-19
    1.7 碱性纤维素酶的应用  19-20
    1.8 碱性纤维素酶研究的市场前景与存在问题  20-22
第二章产碱性纤维素酶软化芽孢杆菌IS-B4的选育  22-34
  引言  22
  1.材料与方法  22-26
    1.1 菌种  22
    1.2 主要试验仪器  22
    1.3 主要试剂  22-23
    1.4 培养基  23
    1.5 出发菌株的特征  23
    1.6 生长曲线的测定  23
    1.7 高产菌株的选育  23-25
      1.7.1 菌悬液的制备  23
      1.7.2 紫外(UV)辐射诱变  23-24
      1.7.3 硫酸二乙酯(DES)诱变  24
      1.7.4 He-Ne激光诱变  24
      1.7.5 UV+DES复合诱变  24
      1.7.6 初筛  24
      1.7.7 复筛  24-25
      1.7.8 遗传稳定性试验  25
    1.8 粗酶液制备  25
    1.9 酶活力测定  25-26
      1.9.1 试剂配制  25
      1.9.2 测定方法  25-26
  2.结果与分析  26-32
    2.1 出发菌株的形态和生理生化特征  26
    2.2 高产菌株选育  26-32
      2.2.1 紫外线(UV)诱变  26-28
      2.2.2 硫酸二乙酯(DES)诱变  28-29
      2.2.3 He-Ne激光诱变  29-30
      2.2.4 UV+DES复合诱变  30-31
      2.2.5 突变株IS-B4的诱变选育流程及产酶曲线  31-32
  3.小结与讨论  32-34
第三章菌株IS-B4产碱性纤维素酶的摇瓶发酵条件优化  34-44
  引言  34
  1.材料和方法  34-36
    1.1 材料  34
    1.2 培养基、粗酶液制备、酶活测定  34
    1.3 生物量测定  34-35
    1.4 发酵产酶培养基组分筛选  35
      1.4.1 不同碳源、氮源对菌株发酵产酶的影响  35
      1.4.2 金属离子对菌株发酵产酶的影响  35
    1.5 正交优化试验  35
    1.6 菌株IS-B4的产酶培养条件优化  35-36
      1.6.1 培养温度对菌株IS-B4发酵产酶的影响  35
      1.6.2 初始pH对菌株IS-B4发酵产酶的影响  35-36
      1.6.3 摇瓶装液量对菌株IS-B4发酵产酶的影响  36
      1.6.4 接种量对菌株IS-B4发酵产酶的影响  36
  2.结果和分析  36-43
    2.1 不同碳源、氮源对菌株IS-B4产CMCASE的影响  36-37
    2.2 金属离子对菌株IS-B4产CMCASE的影响  37-38
    2.3 产酶培养基的配方优化  38-39
    2.4 培养条件的优化  39-42
      2.4.1 培养温度对IS-B4产酶的影响  39-40
      2.4.2 培养基初始pH值对菌株IS-B4产CMCase的影响  40-41
      2.4.3 装液量对IS-B4产酶影响  41-42
      2.4.4 不同接种量对IS-B4产酶的影响  42
    2.5 突变株IS-B4在基础培养基与优化条件下的产酶进程  42-43
  3.小结与讨论  43-44
第四章菌株IS-B4产碱性纤维素酶的5L发酵罐发酵条件优化与酶学性质的初步研究  44-55
  引言  44
  1.材料与方法  44-46
    1.1 材料  44-45
      1.1.1 菌种  44
      1.1.2 发酵培养基(w%)  44
      1.1.3 主要仪器与设备  44-45
    1.2 5L发酵罐发酵条件  45
    1.3 溶氧的测定  45
    1.4 生物量测定  45
    1.5 粗酶制剂的制备  45
    1.6 酶活力的测定  45
    1.7 酶的一些性质的研究  45-46
      1.7.1 pH对酶活及稳定性的影响  45-46
      1.7.2 温度对酶活及酶的热稳定性的影响  46
      1.7.3 金属离子及化学因子对酶活的影响  46
  2.结果与分析  46-54
    2.1 嗜碱芽孢杆菌IS-B45L发酵罐中的发酵规律  46-49
    2.2 嗜碱芽孢杆菌IS-B45L发酵罐发酵条件的优化  49-51
      2.2.1 提高搅拌转速对菌体发酵产酶的影响  49-50
      2.2.2 通气量对菌体发酵产酶的影响  50-51
    2.3 酶的一些性质  51-54
      2.3.1 pH值对酶活及稳定性的影响  51-52
      2.3.2 酶反应的热稳定性  52-53
      2.3.3 金属离子和化学因子对酶活的影响  53-54
  3.小结与讨论  54-55
本文小结  55-57
  1.本文的主要研究成果  55-56
  2.后续研究展望  56-57
参考文献  57-61

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