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土星拟威尔酵母WC91-2菌株β-1，3-葡聚糖酶基因的敲除

作　者: 张雪
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 海洋嗜杀酵母基因敲除嗜杀因子 β-1,3-葡聚糖酶 W. saturnus WC91-2
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 29次
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内容摘要

一些海洋致病酵母菌能够引起海洋动物的疾病,给海水养殖业造成了巨大的损失。研究表明,嗜杀酵母能够应用于抑制动、植物中病原酵母菌的生长,作为一种有效控制病原酵母菌的方法已经引起了人们的广泛关注。海洋嗜杀酵母Williopsis saturnus WC91-2分离于海底沉积物,具有较广的抗菌谱,对于能够引起梭子蟹“乳化病”的Metschnikowia bicuspidate WCY抑制作用强烈。研究发现该菌株的β-1,3-葡聚糖酶与其产生的嗜杀因子之间存在抑制作用。为了提高该嗜杀酵母菌的嗜杀活性,敲除其β-1,3-葡聚糖酶基因是很有必要的。将Zeocin基因作为标记基因,构建敲除编码β-1,3-葡聚糖酶基因WsEXG1的敲除载体pMD19-WsEXG1-Zeocin,该敲除载体包含有WsEXG1基因启动子:Zeocin基因:WsEXG1基因终止子的片段,然后将敲除载体转化野生型菌株WC91-2。β-1,3-葡聚糖酶酶活的测定结果显示转化菌株的β-1,3-葡聚糖酶酶活普遍低于野生型菌株的,最低达到0.71U/mL,同时转化菌株的嗜杀活性也普遍增强,抑菌圈直径由野生型菌株的9±0.6mm增大到13±0.5mm。为了获得WsEXG1基因完全被敲除的纯合子,在一定条件下诱导转化菌株产生子囊孢子并萌发形成子囊孢子菌落。通过对不同子囊孢子菌落β-1,3-葡聚糖酶活性的测定,筛选出酶活最低的一株命名为WC91-2-2,测定其β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.45U/mL,该菌株比野生型菌株产生更多的嗜杀因子。PCR检测显示Zeocin基因插入到W.saturnus WC91-2-2 WsEXG1基因的开放阅读框中。以葡萄糖作为碳源,采用单次因子方法对敲除菌株摇瓶产嗜杀因子培养基及培养条件进行优化,得到最适产嗜杀因子的培养基组分是(w/v):葡萄糖1.0%,酵母粉3.0%,NaCL浓度0%,培养基初始pH为4.5。最佳培养条件为:在24℃和180 rpm下振荡培养72 h。在此最佳条件下培养,敲除菌株的嗜杀因子最大抑菌圈可以达到19±0.8mm,而WC91-2菌株最大抑菌圈是13±0.6mm,β-1,3-葡聚糖酶的活性也由1.6U/mL降低到0.2U/mL。本文研究了土星拟威尔酵母在2 L酵罐中产嗜杀因子情况。结果表明:在24℃、通气量为8L/mL、转速为250rpm的条件下,发酵36h之内,敲除菌株嗜杀因子产生的抑菌圈直径达到最大值为22±0.8mm。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-30
  1 嗜杀酵母及嗜杀因子的简介  12-21
    1.1 自然界的嗜杀现象及嗜杀酵母  12-16
      1.1.1 海洋致病酵母  12-13
      1.1.2 嗜杀酵母的发现  13
      1.1.3 嗜杀酵母的分类  13-14
      1.1.4 海洋环境中的嗜杀酵母  14-16
    1.2 嗜杀因子  16-19
      1.2.1 嗜杀因子的性质  16-17
      1.2.2 嗜杀因子的产生条件  17
      1.2.3 嗜杀因子的作用机制  17-18
      1.2.4 嗜杀因子的检测方法  18-19
    1.3 嗜杀酵母和嗜杀因子的应用  19-21
      1.3.1 嗜杀酵母及嗜杀因子的应用前景  19-21
  2 β-1,3-葡聚糖酶与嗜杀因子之间相互作用关系的讨论  21-24
  3 基因敲除技术及其在遗传育种方面的应用  24-28
    3.1 基因敲除技术的概述  24
    3.2 基因敲除的常用技术  24-27
      3.2.1 利用同源重组技术进行敲除  24-26
      3.3.2 RNAi—双链RNA 引起的基因敲除  26-27
      3.2.3 利用随机插入突变的技术进行敲除  27
    3.3 基因敲除技术在遗传育种方面的应用  27-28
      3.3.1 研究生物个体基因的结构与功能  27
      3.3.2 改良工业生产菌株  27-28
      3.3.3 提高微生物菌株产物浓度  28
    3.4 基因敲除技术存在的问题  28
  4 本论文研究的意义  28-30
第二章土星拟威尔酵母W saturnus WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的敲除  30-56
  0 前言  30-31
  1 材料与方法  31-42
  2 结果与讨论  42-55
    2.1 敲除载体pMD19-WsEXG1-Zeocin 的构建  42-45
    2.2 转化及阳性转化子的筛选  45-47
    2.3 野生型菌株和敲除菌株β-1,3-葡聚糖酶活性的比较  47
    2.4 野生型菌株和敲除菌株嗜杀活性的比较  47-48
    2.5 WC91-2-A 菌株产生子囊孢子  48-55
      2.5.1 子囊孢子的培养和产生  48-49
      2.5.2 子囊孢子的释放和萌发  49-50
      2.5.3 野生型菌株和子囊孢子萌发后菌株β-1,3-葡聚糖酶活性的比较  50-51
      2.5.4 敲除菌株WC91-2-2 插入Zeocin 基因的验证  51-52
      2.5.5 WC91-2 菌株与WC91-2-2 菌株嗜杀活性的比较  52-53
      2.5.6 WC91-2 菌株与WC91-2-2 菌株细胞生长情况的比较  53-55
  3 本章小结  55-56
第三章嗜杀酵母敲除菌株产嗜杀因子摇瓶条件的优化  56-66
  0 前言  56-57
  1 材料与方法  57-59
  2 结果与讨论  59-65
    2.1 不同碳源及其浓度对嗜杀因子产量的影响  59-60
    2.2 不同氮源及其浓度对嗜杀因子产量的影响  60-61
    2.3 不同盐浓度对嗜杀因子产量的影响  61
    2.4 培养基初始PH 值对嗜杀因子产量的影响  61-62
    2.5 不同培养温度对嗜杀因子产量的影响  62
    2.6 不同转速对嗜杀因子产量的影响  62-63
    2.7 优化培养基和初始培养基β-1,3-葡聚糖酶活性与嗜杀因子产量的比较  63-65
  3 本章小结  65-66
第四章嗜杀酵母敲除菌株发酵生产嗜杀因子的研究  66-71
  0 前言  66
  1 材料与方法  66-67
  2 结果与讨论  67-70
    2.1 发酵培养过程中的细胞生长曲线  67-68
    2.2 发酵培养过程中的β-1,3-葡聚糖酶活性的变化  68-69
    2.3 发酵培养过程中嗜杀因子活性的变化  69-70
    2.4 发酵培养过程中培养基还原糖总量的变化  70
  3 本章小结  70-71
论文的创新点与展望  71-73
  1 论文总结  71-72
  2 论文创新点  72-73
参考文献  73-78
附录：英文缩写符号及其中英文名称  78-80
致谢  80-81
个人简历及发表的学术论文  81
  个人简历  81
  攻读硕士学位期间发表的学术论文  81

土星拟威尔酵母WC91-2菌株β-1，3-葡聚糖酶基因的敲除

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