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稻瘟病菌三个侵染表达上调基因的功能研究

作　者: 黄春荣
导　师: 鲁国东；王宗华
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 基因敲除 过量表达 致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 68次
引　用: 2次
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内容摘要


稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是目前研究丝状真菌的重要模式生物。为了探索水稻与稻瘟病菌互作的分子机理,本文从稻瘟病菌全基因组基因芯片中挑选了三个该菌侵染水稻后表达上调倍数比较高的基因,对它们进行基因敲除,同时对其中的两个基因进行过量表达,分析它们的表型变化,以初步确定它们在稻瘟病菌侵染致病过程中的作用。首先构建了三个基因的敲除载体和MGG06834.6与MGG03891.6基因的过量表达载体,然后通过原生质体转化,获得基因的缺失突变体和过量表达突变体。突变体表型分析发现,MGG03356.6缺失突变体在菌落形态,孢子萌发,致病性方面与野生型没有显著差别,而在疏水性表面上附着胞形成率比野生型菌株KU70低;MGG06834.6缺失突变体的表型与对照菌株也没有明显变化,但过量表达突变体的产孢量降低,且附着胞形成提前,而致病性减弱;MGG03891.6的缺失突变体的表型与野生型菌株没有显著差别,但过量表达突变体的附着胞形成滞后,且致病性也有所减弱。RT-PCR分析表明,MGG06834.6和MGG03891.6在野生型菌株中表达量很低。这些结果表明它们可能在稻瘟病菌侵染致病过程中充当一定的作用。同时,我们利用SDS的胁迫来观察细胞壁的完整性,实验结果发现,敲除MGG03356.6和MGG03891.6基因对细胞的完整性影响不明显,而敲除MGG06834.6基因后病菌对SDS抗性较弱,说明细胞完整性减弱,因此MGG06834.6可能是细胞完整性的调控因子。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
1 前言  10-18
  1.1 稻瘟病和稻瘟病菌概况  10-13
    1.1.1 稻瘟病菌的分类地位及其侵染循环过程  10-11
    1.1.2 稻瘟病菌致病相关基因研究进展  11-13
      1.1.2.1 稻瘟病菌分生孢子形态及产孢相关基因  11-12
      1.1.2.2 稻瘟病菌附着胞形成相关基因  12-13
  1.2 凝集素的概况  13-15
    1.2.1 真菌凝集素的研究现状  13-14
    1.2.2 真菌凝集素的生物学特性  14
    1.2.3 真菌凝集素的生物学活性  14
    1.2.4 真菌凝集素的应用  14-15
  1.3 纤维素酶的概况  15-16
    1.3.1 纤维素酶的特性  15
    1.3.2 纤维素酶的应用  15-16
  1.4 丝状真菌基因敲除技术研究进展  16-17
    1.4.1 基因敲除的概念  16
    1.4.2 基因敲除在丝状真菌研究中的应用  16-17
      1.4.2.1 研究基因的结构与功能  16-17
      1.4.2.2 改良工业生产菌株  17
      1.4.2.3 次生代谢产物合成途径改造  17
  1.5 本课题研究的目的和意义  17-18
2 材料与方法  18-30
  2.1 试验材料  18-19
    2.1.1 供试菌株  18
    2.1.2 供试植物  18
    2.1.3 供试载体  18
    2.1.4 培养基  18
    2.1.5 生化试剂  18-19
  2.2 实验方法  19-30
    2.2.1 蛋白序列获得与分析  19
    2.2.2 稻瘟病菌基因组DNA 的提取及质量的检测  19
    2.2.3 DNA 琼脂糖电泳  19
    2.2.4 PCR 扩增  19-20
    2.2.5 PCR 产物的凝胶回收  20
    2.2.6 PCR 产物的TA 克隆  20-21
    2.2.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化  21
    2.2.8 质粒DNA 的提取  21-22
    2.2.9 质粒DNA 的酶切与连接  22
    2.2.10 三个基因敲除载体的构建  22-24
    2.2.11 MGG_06834.6 和MGG_03891.6 过量表达载体的构建  24
    2.2.12 稻瘟病菌原生质体的制备  24-25
    2.2.13 稻瘟病菌原生质体转化和转化子的验证  25-26
    2.2.14 稻瘟病菌菌丝Total RNA 的提取及检测  26
    2.2.15 RT-PCR 反转录  26-27
    2.2.16 稻瘟病菌突变体的表型观察  27-30
      2.2.16.1 菌落生长速度测定  27
      2.2.16.2 产孢量统计及孢子形态观察  27-28
      2.2.16.3 孢子萌发、附着胞形成及形态观察试验  28
      2.2.16.4 洋葱表皮内侵染结构的观察  28
      2.2.16.5 大麦离体接种试验  28
      2.2.16.6 水稻活体接种试验  28-29
      2.2.16.7 SDS 对突变体细胞完整性的影响试验  29-30
3 结果与分析  30-57
  3.1 稻瘟病菌MGG_03356.6 的生物信息学分析和功能研究  30-37
    3.1.1 MGG_03356.6 的生物信息学分析  30
    3.1.2 MGG_03356.6 敲除载体的构建  30
    3.1.3 MGG_03356.6 敲除突变体的筛选与验证  30-31
    3.1.4 MGG_03356.6 敲除突变体的表型分析  31-37
      3.1.4.1 MGG_03356.6 缺失引起产孢量减少  32-33
      3.1.4.2 MGG_03356.6 缺失使稻瘟病菌菌丝生长稍微减慢  33
      3.1.4.3 MGG_03356.6 敲除突变体的孢子萌发及附着胞形成  33-34
      3.1.4.4 MGG_03356.6 的敲除突变体对大麦和水稻的致病性正常  34-36
      3.1.4.5 MGG_03356.6 缺失突变体对细胞完整性的影响  36-37
  3.2 稻瘟病菌MGG_06834.6 的生物信息学分析和功能研究  37-47
    3.2.1 MGG_06834.6 的生物信息学分析  37-38
    3.2.2 MGG_06834.6 敲除载体的构建  38-39
    3.2.3 MGG_06834.6 敲除突变体的筛选与验证  39
    3.2.4 MGG_06834.6 过量表达载体的构建  39
    3.2.5 MGG_06834.6 过量表达突变体的筛选与验证  39-41
    3.2.6 MGG_06834.6 敲除突变体和过量表达突变体的表型分析  41-47
      3.2.6.1 MGG_06834.6 过量表达引起产孢量减少  41-42
      3.2.6.2 MGG_06834.6 敲除或过量突变体的菌丝生长略慢  42-43
      3.2.6.3 MGG_06834.6 敲除与过量表达突变体的孢子萌发及附着胞形成  43-44
      3.2.6.4 MGG_06834.6 的过量表达突变体的致病性减弱  44-46
      3.2.6.5 MGG_06834.6 缺失突变体对细胞完整性的影响  46-47
  3.3 稻瘟病菌MGG_03891.6 的生物信息学分析和功能研究  47-57
    3.3.1 MGG_03891.6 的生物信息学分析  47-48
    3.3.2 MGG_03891.6 敲除载体的构建  48
    3.3.3 MGG_03891.6 敲除突变体的筛选与验证  48-49
    3.3.4 MGG_03891.6 过量表达载体的构建  49-50
    3.3.5 MGG_03891.6 过量表达突变体的筛选与验证  50
    3.3.6 MGG_03891.6 敲除突变体和过量表达突变体的表型分析  50-57
      3.3.6.1 MGG_03891.6 过量表达引起产孢量减少  50-52
      3.3.6.2 MGG_03891.6 敲除或过量突变体的菌丝生长正常  52
      3.3.6.3 MGG_03891.6 敲除与过量表达突变体的孢子萌发及附着胞形成  52-53
      3.3.6.4 MGG_03891.6 的过量表达突变体的致病性减弱  53-55
      3.3.6.5 MGG_03891.6 缺失突变体对细胞完整性的影响  55-57
4 小结与讨论  57-60
  4.1 三个基因敲除和过量表达突变体的表型小结  57
  4.2 MGG_03356.6 基因敲除后不影响致病性  57-58
  4.3 MGG_06834.6 基因功能冗余  58
  4.4 MGG_06834.6 基因可能是细胞完整性调控因子  58
  4.5 MGG_06834.6 和 MGG_03891.6 基因的过量表达影响了致病性  58-60
参考文献  60-66
附录1  66-68
致谢  68

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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