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华北大黑鳃金龟气味结合蛋白功能分析

作　者: 邓思思
导　师: 李克斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 华北大黑鳃金龟气味结合蛋白荧光竞争结合试验触角电位图免疫化学定位
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

自然界中,昆虫个体之间、昆虫与环境之间的顺利交流是维持这些物种生存与发展的重要原因之一,而昆虫灵敏的嗅觉在其中又起到了关键的作用。借助嗅觉系统昆虫能够定位寄主、配偶,躲避天敌的捕捉以及避免有毒物质,触角作为感受外界环境的直接器官成为嗅觉系统中不可或缺的一部分,其中的各种有功能的蛋白则是维持正常嗅觉的基础。华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann是我国北方的一种重要的地下害虫,其广泛的寄主植物和隐蔽的生活环境导致防控困难,对农业生产、生活造成了严重的破坏。为了能更好的增进对华北大黑鳃金龟嗅觉机制的认识,以科学、绿色的方法对其进行调控、防治,我们通过分子生物学手段获得了华北大黑鳃的两种气味结合蛋白,并对其功能进行了研究,同时进行了电生理学和行为学方面的试验从宏观角度了解这两种蛋白可能的作用。主要研究成果如下:(1)通过RACE技术获得了两条华北大黑鳃金龟气味结合蛋白基因全长,并在Genbank中登录,登录号为:GQ856257,GQ856258。通过生物信息学方法对其序列进行分析,研究了它们与其他鞘翅目昆虫和其他目昆虫和气味结合蛋白的亲缘关系。(2)表达纯化了OBP1和OBP2融合蛋白,并通过重组肠激酶切除了表达标签。通过荧光竞争结合试验,利用1-NPN为荧光探针研究了它们对73种气味分子的结合能力。结果显示:OBP1与OBP2能够较为广泛的结合植物挥发物,但是对信息素化合物结合能力有限。其中,花香类化合物β-紫罗兰酮在本结合试验中是两个气味结合蛋白最好的配体。OBP1对能够引起华北大黑鳃金龟强烈趋性的蓖麻的部分挥发物有较强的结合能力。OBP2对能引起引诱其他种类金龟子的丁子香酚有好的结合能力,对常见植物挥发物水杨酸甲酯亲和力也很强。另外,我们发现两个气味结合蛋白的结合能力还与气味化合物的构象、所带基团和侧链上碳原子个数有密切的关系。(3)选取了部分结合能力较好的化合物和常见的植物挥发物对华北大黑鳃金龟进行电生理学试验,再测试它们对其中能引起较高EAG值的行为学反应。结果显示:反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸顺-3-己烯酯、1-己醇、邻氨基苯甲酸甲酯、水杨酸甲酯对华北大黑鳃金龟的吸引能力都显著高于对照正己烷,但辛醛和苯乙醇对华北大黑鳃金龟的吸引作用低于对照正己烷。结合荧光竞争结果来看,OBP1和OBP2分别对能引起较高EAG值和显著行为反应的部分植物挥发物有良好的亲和性,如水杨酸甲酯、芳樟醇等。同时,我们发现有些物质能引起华北大黑鳃触角较高EAG值却不能与两个蛋白结合或者结合能力很弱。我们推测,这可能是有更多种的不同功能的OBPs存在于华北大黑鳃金龟基因组中,通过在嗅觉系统中分工合作来实现对各种气味的反应。(4)利用纯化并去除His-tag的蛋白免疫家兔,获得了OBP1和OBP2的多克隆抗体。通过免疫电镜试验观察两个气味结合蛋白在触角感器中的分布情况。结果显示,两个气味结合蛋白抗体均能标记雌雄华北大黑鳃金龟触角中的主要感器板型感器和锥形感器。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章引言  12-26
  1.1 昆虫的触角感器  12-14
    1.1.1 昆虫的触角的外部形态  12
    1.1.2 昆虫的触角感器的类型和结构  12-14
  1.2 植物挥发物和昆虫信息素  14-15
    1.2.1 植物挥发物  14-15
    1.2.2 昆虫信息素  15
  1.3 昆虫的嗅觉机制  15-23
    1.3.1 嗅觉编码的一般过程  16-17
    1.3.2 气味结合蛋白  17-21
      1.3.2.1 气味结合蛋白的种类和特征  17-18
      1.3.2.2 气味结合蛋白的结构  18-19
      1.3.2.3 气味结合蛋白的功能  19-21
    1.3.3 昆虫嗅觉编码中涉及的其他重要蛋白  21-23
  1.4 金龟子化学通讯的研究进展  23-25
  1.5 研究目的和内容  25-26
第二章华北大黑鳃金龟 OBP1 和 OBP2 基因克隆及序列分析  26-43
  2.1 材料与方法  26-34
    2.1.1 供试昆虫与主要试剂  26-27
    2.1.2 华北大黑鳃金龟子触角总RNA 提取  27
    2.1.3 cDNA 第一链合成  27-28
    2.1.4 简并引物扩增OBP1 和OBP1 部分序列  28
    2.1.5 PCR 产物回收  28-29
    2.1.6 连接体系  29
    2.1.7 重组质粒转化感受态细胞  29
    2.1.8 提质粒  29-30
    2.1.9 3’RACE  30-31
    2.1.10 5’RACE  31-34
  2.2 结果与分析  34-41
    2.2.1 触角总RNA 提取  34
    2.2.2 OBP1 与 OBP2 基因部分序列的获得  34-35
    2.2.3 3’RACE  35
    2.2.4 5’RACE  35-36
    2.2.5 序列分析  36-41
  2.3 讨论  41-43
第三章华北大黑鳃金龟 OBP1 和 OBP2 的表达纯化及其结合特征的分析  43-56
  3.1 材料与方法  43-47
    3.1.1 试剂  43
    3.1.2 引物设计  43-44
    3.1.3 OBP1 和 OBP2 原核表达载体的构建  44-47
  3.2 结果与分析  47-55
    3.2.1 华北大黑鳃金龟OBP1 与OBP2 原核表达载体的构建  47-48
    3.2.2 原核表达及蛋白纯化  48-51
    3.2.3 OBP1 和 OBP2 结合特征分析  51-55
  3.4 讨论  55-56
第四章华北大黑鳃金龟对植物源气味物质的电生理学与行为学反应  56-63
  4.1 材料与方法  56-58
    4.1.1 供试昆虫与材料  56
    4.1.2 触角的处理方法  56-57
    4.1.3 EAG 测试程序  57
    4.1.4 嗅觉反应测试  57-58
    4.1.5 数据处理  58
  4.2 结果与分析  58-61
    4.2.1 华北大黑鳃金龟对气味物质的EAG 反应  58
    4.2.2 雌雄成虫对气味物质的EAG 反应  58-59
    4.2.3 嗅觉反应测试  59-61
  4.3 讨论  61-63
第五章 OBP1 和OBP2 在触角感器中的定位研究  63-68
  5.1 供试昆虫与试剂  63-64
    5.1.1 供试昆虫  63
    5.1.2 抗体制备  63-64
    5.1.3 溶剂  64
    5.1.4 免疫电镜样品制备  64
  5.2 结果与分析  64-67
    5.2.1 抗体效价  64-65
    5.2.2 免疫化学定位  65-67
  5.3 讨论  67-68
第六章结论与展望  68-70
  6.1 结论  68-69
    6.1.1 气味结合蛋白基因的克隆  68
    6.1.2 OBP1 与 OBP2 的表达及结合特征的分析  68-69
    6.1.3 电生理和行为学研究  69
    6.1.4 OBP1 与 OBP2 的定位研究  69
  6.2 展望  69-70
参考文献  70-82
致谢  82-83
作者简历  83

华北大黑鳃金龟气味结合蛋白功能分析

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