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苏云金芽孢杆菌Cry1Ba3蛋白定点突变对杀小菜蛾活性的影响

作　者: 林承喜
导　师: 林毅
学　校: 华侨大学
专　业: 生物化工
关键词: Cry1Ba3 定点突变 生物活性测定 小菜蛾
分类号: TQ458
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 17次
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内容摘要


苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是迄今为止研究和应用最为广泛的一类微生物杀虫剂。Bt的杀虫活性主要来自于生长过程中产生的伴孢晶体蛋白,亦称杀虫晶体蛋白ICPs(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)。ICPs的杀虫活性与氨基酸及结构间的关系是目前研究的热点。Cry1Ba3是由本实验室发掘的对小菜蛾有高毒力的杀虫晶体蛋白。为了寻找对杀虫活性有重要影响的氨基酸,本研究通过以下几个步骤对Cry1Ba3进行了分析:在Swiss—Model数据库中,对Cry1Ba3的三维结构进行同源建模,初步确定Cry1Ba3三个主要结构域的位置:DomainⅠ位于1~270,DomainⅡ位于280~480,DomainⅢ位于500~630。采用BioEdit软件分析Cry1Ba3的疏水区,发现在60~80, 260~263, 397~404三个疏水区。最后,将Cry1Ba3与Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1以及Cry4Ba1进行多序列比对,从而确定了40个突变位点。利用半重叠引物PCR的方法对Cry1Ba3进行定点突变,获得40个突变体(Ms~M39),并在大肠杆菌(Escherichia coli,简称E.coli) BL21中进行诱导表达。将获得的突变蛋白采用浸叶法进行小菜蛾和大猿叶甲生物活性测定,实验结果表明:突变体M6(R171L)、M10(W282A)、M19(H485G)对小菜蛾的活性明显降低,其中突变蛋白M6(R171L)的活性完全丧失,突变蛋白M10(W282A)的活性降低49倍,突变蛋白M19(H485G)的活性降低44倍。将所有突变及野生型蛋白序列提交到P?le Bio-Informatique Lyonnais网站的NPS@数据库进行SOPMA二级机构预测。通过对结果的分析发现,活性没有明显变化的突变对蛋白的结构的普遍没有影响,而活性变化明显的突变均对蛋白的局部结构产生不可逆的改变。本研究确定了三个Cry1Ba3的杀虫活性有重要影响的关键氨基酸,能够今后关于机理方面的研究提供方法以及理论方面的参考;同时还能为今后合成全新的高毒力广谱杀虫蛋白理论依据,为提高农业生产及节省科研资源作出一定的贡献。

全文目录


论文摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章 引言  10-27
  1.1 杀虫晶体蛋白的分类  11
  1.2 杀虫晶体蛋白的结构  11-15
  1.3 杀虫晶体蛋白结构与功能的关系  15-18
    1.3.1 Domain I 与杀虫活性的关系  15-16
    1.3.2 Domain II 与杀虫活性的关系  16
    1.3.3 Domain Ⅲ与杀虫活性的关系  16-17
    1.3.4 Loop 与杀虫活性的关系  17-18
  1.5 杀虫晶体蛋白的杀虫机理  18-21
  1.6 杀虫晶体蛋白的分子设计  21-26
    1.6.1 Domain I 的突变研究  21-23
    1.6.2 Domain Ⅱ的突变研究  23-25
    1.6.3 Domain Ⅲ的突变研究  25-26
  1.7 cry1Ba 基因及其蛋白介绍  26
  1.8 本研究立题依据和目的意义  26-27
第二章 材料与方法  27-37
  2.1 材料与试剂  27-30
    2.1.1 菌株和质粒  27-28
    2.1.2 培养基  28
    2.1.3 主要试剂  28-29
    2.1.4 实验所需溶液配制  29
    2.1.5 供试昆虫  29
    2.1.6 仪器设备  29-30
  2.2 实验方法  30-37
    2.2.1 Cry1Ba3 蛋白序列分析  30
    2.2.2 引物设计  30-31
    2.2.3 E. coli 质粒提取  31
    2.2.4 突变质粒的构建  31-32
    2.2.5 DNA 凝胶回收  32
    2.2.6 E. coli 感受态细胞制备  32
    2.2.7 突变体质粒转化  32-33
    2.2.8 突变质粒的筛选及鉴定  33
    2.2.9 突变体质粒转化E. coli BL21  33
    2.2.10 蛋白的诱导表达与蛋白提取  33-34
    2.2.11 小菜蛾生物活性测定  34-35
    2.2.12 大猿叶甲生物活性测定  35-36
    2.2.13 突变蛋白二级结构分析  36-37
第三章 结果与讨论  37-51
  3.1 结果与分析  37-49
    3.1.1 Cry1Ba3 蛋白序列分析  37-39
    3.1.2 突变引物设计和合成  39-41
    3.1.3 突变质粒的构建  41-42
    3.1.4 突变蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 检测  42-43
    3.1.5 突变蛋白杀小菜蛾生物活性测定  43-47
    3.1.6 突变蛋白杀大猿叶甲生物活性测定  47
    3.1.7 突变蛋白二级结构预测  47-49
  3.2 讨论  49-51
第四章 全文主要结论和展望  51-52
参考文献  52-61
致谢  61-62
附录  62

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 农药工业 > 微生物农药
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