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苜蓿盲蝽嗅觉相关基因的发掘及功能分析

作　者: 谷少华
导　师: 张永军
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 苜蓿盲蝽 触角感器 触角cDNA文库 生物信息学分析 嗅觉相关基因 基因表达模式 气味结合蛋白 竞争结合 三维结构
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


昆虫个体之间以及昆虫与环境之间的关系主要靠化学通讯来调节。其中嗅觉系统对于昆虫的生存和繁衍至关重要,作为一个高度特异和灵敏的化学感应器,昆虫可以利用触角来检测、识别、转导来自环境中的化学信号并进而引发相关的行为学反应,如定位寄主植物、交配产卵、躲避有毒物质及捕食者。阐明昆虫嗅觉识别的机制可以帮助我们设计新的方法来进行害虫治理。苜蓿盲蝽是我国棉花生产上一类重要的害虫,每年都对棉花产量造成严重的损失。有证据表明盲蝽蟓可以感受特定的寄主挥发物和性信息素来进行定位寄主植物和交配产卵。嗅觉相关蛋白已被证明在昆虫嗅觉识别中是必需的,在防治苜蓿盲蝽中可作为新的靶标基因。本文通过构建苜蓿盲蝽的雌雄触角cDNA文库,通过生物信息学方法筛选到苜蓿盲蝽嗅觉相关基因,并对相关嗅觉基因在苜蓿盲蝽嗅觉识别中的功能进行了研究。主要研究结果如下：1.扫描电镜观察到苜蓿盲蝽触角呈线状,由柄节、梗节和鞭节组成。触角上存在4种感受器,分别是毛形感器、刺形感器、锥形感器和Bohm氏鬃毛。2.利用SMART技术成功构建苜蓿盲蝽雌雄触角的cDNA文库,通过生物信息学方法发掘筛选到若干嗅觉相关基因,其中包括14个气味结合蛋白基因、8个化学感受蛋白基因、2个气味受体基因、8个气味降解酶候选基因。3.利用Real-time PCR方法解析了14个苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因(AlinOBP1-AlinOBP 14)在成虫不同组织间的表达谱。根据在各组织间的表达量差异将这14个OBP基因分成4类,ClassⅠ包括9个OBPs基因(Alin-OBP1,Alin-OBP2,Alin-OBP3,Alin-OBP4,Alin-OBP5,Alin-OBP6, Alin-OBP8,Alin-OBP12和Alin-OBP13),主要在触角中表达；ClassⅡ包括1个OBP基因(Alin-OBP11),主要在足和头部表达；ClassⅢ包括1个OBP基因(Alin-OBP14),几乎全部在头部表达；ClassⅣ包括3个OBP基因(Alin-OBP7,Alin-OBP9和Alin-OBP10),主要在雄性触角、雌性触角、头和足中表达,表达量相差不多。4.克隆、表达和纯化了一个新的苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP 1,以1-NPN为荧光探针采用荧光竞争结合实验检测了AlinOBP 1蛋白和114种不同种类的气味分子的结合谱。结果显示AlinOBP 1与其两个性信息素类似物丁酸乙酯和丁酸反-2-己烯酯有着很强的结合能力,另外,6种棉花挥发物辛醛、壬醛、葵醛、异辛醇、β-石竹烯和β-紫罗兰酮与AlinOBP 1也有着很强的结合能力。结合实验表明AlinOBP 1能够同时结合其性信息素类似物和某些棉花挥发物,揭示AlinOBP 1在苜蓿盲蝽的嗅觉识别中可能具有多重功能。以家蚕性信息结合蛋白BmorPBP的三维结构为模板对AlinOBP 1的三维结构模型进行了预测,结果显示,AlinOBP 1蛋白的结合口袋主要由疏水性氨基酸组成,这些疏水性氨基酸可能与配体气味分子的疏水性部分能够发生相互作用。但是与此同时也有5个亲水性氨基酸(Asp19,Thr22,Asn23,Glu79和Lys102)位于结合口袋处,可能为识别配基气味分子的初始结合位点。5.克隆、表达和纯化了一个新的苜蓿盲蝽气味结合结合蛋白AlinOBP3,以1-NPN为荧光探针用荧光竞争结合实验研究了AlinOBP3蛋白与9种棉花挥发物及5种性信息素类似物的结合能力。结果表明,在9种棉花挥发物中,月桂烯、β-罗勒烯、α-水芹烯能够和AlinOBP3相结合,其中α-水芹烯和AlinOBP3的结合能力较强,结合常数为56.68μmol/L。在5种性信息素类似物中,丁酸己酯和AlinOBP3的结合能力最强,结合常数为59.53μmol/L,丁酸丁酯、丁酸反-2-己烯酯、丁酸乙酯和AlinOBP3的结合能力中等,结合常数分别为227.39μmol/L,108.77μmol/L和143.47μmol/L。据此推测,AlinOBP3可能是性信息素结合蛋白(pheromone binding protein, PBP)并在感受性信息素和植物挥发物的过程中发挥双重作用。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
目录  10-13
第一章 文献综述  13-29
  1.1 昆虫的触角感器及功能  13-16
    1.1.1 昆虫触角感器的结构及感受机制  13-15
    1.1.2 昆虫触角上的感受器类型及功能  15-16
  1.2 昆虫气味结合蛋白研究进展  16-21
    1.2.1 气味结合蛋白的种类  16
    1.2.2 气味结合蛋白的表达  16-17
    1.2.3 气味结合蛋白的分子结构  17-19
    1.2.4 气味结合蛋白的功能研究  19-21
  1.3 昆虫化学感受蛋白研究进展  21-22
    1.3.1 昆虫化学感受蛋白的种类  21
    1.3.2 化学感受蛋白的分子结构  21
    1.3.3 化学感受蛋白的分布  21-22
    1.3.4 化学感受蛋白的功能  22
  1.4 气味受体研究进展  22-26
    1.4.1 脊椎动物、线虫和昆虫中的气味受体  22-23
    1.4.2 气味受体的分子结构  23-25
    1.4.3 气味受体的功能研究  25
    1.4.4 非典型气味受体Or83b的功能研究  25-26
  1.5 昆虫气味降解酶研究进展  26
  1.6 感觉神经元膜蛋白(SNMP)的研究进展  26
  1.7 昆虫触角G蛋白研究进展  26-27
  1.8 研究思路  27-29
    1.8.1 立题依据  27-28
    1.8.2 研究内容  28-29
第二章 苜蓿盲蝽触角感器的扫描电镜观察  29-34
  2.1 材料与方法  29
    2.1.1 供试昆虫  29
    2.1.2 样品的制备与观察  29
    2.1.3 触角感器的鉴定和命名  29
  2.2 结果与分析  29-32
    2.2.1 毛形感器(sensilla trichodea)  30
    2.2.2 刺形感器(sensilla chaetica)  30
    2.2.3 锥形感器(sensilla basiconica)  30
    2.2.4 B(o|¨)hm氏鬃毛(Bohm bristles)  30-32
  2.3 讨论  32-34
第三章 苜蓿盲蝽触角cDNA文库的构建及生物信息学分析  34-48
  3.1 材料与方法  35-39
    3.1.1 触角cDNA文库的构建  35-38
    3.1.2 cDNA文库的生物信息学分析  38-39
  3.2 结果与分析  39-47
    3.2.1 触角cDNA文库质量分析  39-42
    3.2.2 触角cDNA文库的生物信息学分析  42-47
  3.3 讨论  47-48
第四章 苜蓿盲蝽嗅觉相关基因的发掘  48-61
  4.1 嗅觉相关基因的发掘  49-50
    4.1.1 气味结合蛋白基因的发掘  49
    4.1.2 化学感受蛋白基因的发掘  49
    4.1.3 气味受体的发掘  49
    4.1.4 气味降解酶的发掘  49-50
  4.2 结果与分析  50-60
    4.2.1 气味结合蛋白的鉴定  50-54
    4.2.2 化学感受蛋白的鉴定  54-58
    4.2.3 气味受体的鉴定  58-59
    4.2.4 气味降解酶的鉴定  59-60
  4.3 讨论  60-61
第五章 苜蓿盲蝽气味结合蛋白表达谱分析  61-68
  5.1 材料与方法  62-63
    5.1.1 供试昆虫  62
    5.1.2 主要试剂  62
    5.1.3 RNA的提取  62
    5.1.4 第一链cDNA的合成  62
    5.1.5 引物设计  62
    5.1.6 Real-time PCR  62-63
    5.1.7 目的基因和内参基因扩增效率一致性的验证  63
    5.1.8 数据处理  63
  5.2 结果与分析  63-64
    5.2.1 目的基因和内参基因扩增效率的验证  63
    5.2.2 苜蓿盲蝽气味结合蛋白OBPs的表达谱分析 #5  63-64
  5.3 讨论  64-68
第六章 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的功能分析  68-92
  6.1 材料和方法  69-72
    6.1.1 供试昆虫与试剂  69
    6.1.2 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的克隆、表达和纯化  69-71
    6.1.3 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的转录表达谱研究  71-72
    6.1.4 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的结合特性研究  72
    6.1.5 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的三维结构及结合位点预测  72
  6.2 结果与分析  72-90
    6.2.1 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1序列分析  72-74
    6.2.2 AlinOBP1与其他物种气味结合蛋白基因序列比对和进化树构建  74-77
    6.2.3 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的克隆、表达和纯化  77-79
    6.2.4 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的转录表达谱分析  79
    6.2.5 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的结合特性分析  79-88
    6.2.6 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的三维结构及结合位点预测  88-90
  6.3 讨论  90-92
第七章 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP3的结合特性分析  92-107
  7.1 材料和方法  92-97
    7.1.1 供试昆虫与试剂  92
    7.1.2 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的克隆、表达和纯化  92-93
    7.1.3 Western blot分析  93
    7.1.4 qPCR分析AlinOBP3表达谱  93-94
    7.1.5 AlinOBP3序列分析及系统进化树的构建  94
    7.1.6 AlinOBP3蛋白内荧光的测定及猝灭  94
    7.1.7 1-NPN蓝移现象的观察  94-95
    7.1.8 结合实验  95-97
  7.2 结果与分析  97-105
    7.2.1 AlinOBP3的序列及进化树分析  97-100
    7.2.2 AlinOBP3蛋白的表达、纯化和Western blot分析  100-101
    7.2.3 AlinOBP3表达谱分析  101-102
    7.2.4 AlinOBP3蛋白内荧光的产生及猝灭  102-103
    7.2.5 1-NPN蓝移现象的观察  103
    7.2.6 结合实验  103-105
  7.3 讨论  105-107
第八章 结论  107-110
  1. 苜蓿盲蝽触角感器的扫描电镜观察  107
  2. 苜蓿盲蝽触角cDNA文库的构建及生物信息学分析  107
  3. 苜蓿盲蝽嗅觉基因的发掘  107-108
  4. 苜蓿盲蝽气味结合蛋白的表达谱研究  108
  5. 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP1的功能分析  108-109
  6. 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP3的功能分析  109-110
参考文献  110-126
致谢  126-127
作者简历  127-128

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物虫害及其防治
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