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多拷贝pilA基因功能暨水平转移基因hdsp作用机制的初步研究

作　者: 谭在高
导　师: 李越中
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: S.aurantiaca 17044 多拷贝pilA基因 Hdsp蛋白 TPR结构域
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

对已测序粘细菌基因组的分析表明,某一基因在粘细菌的基因组中可能会存在多个拷贝。多拷贝基因的存在被认为是粘细菌适应其复杂社会学行为的结果。标桩菌和堆囊菌的基因组中均存在多个拷贝的pilA基因,pilA基因编码的pilin蛋白组装成type four pili (TFP),而TFP在粘细菌的社会学行为中起到了重要的作用。为了对基因组中存在的多拷贝pilA基因进行功能分析,以分析这些不同拷贝的pilA基因之间是否存在功能差异,我们以S.aurantiaca 17044中的4个拷贝的pilA基因作为研究对象,分析了这4个拷贝的pilA及其编码的pilin蛋白的序列特征,并利用E. coli-M.xanthus穿梭载体pZJY41,通过基因回补的方法,将这4各拷贝的pilA基因分别回补入M.xanthus DK10410(ApilA),并分析了各回补菌株的社会学行为的变化。结果表明,所有回补菌株的胞外多糖EPS产量相对于DK10410而言,均没有得到提高。同时,菌株的群体运动能力也没有得到增强。但是在发育阶段,包含有其中pilA-1基因的回补菌株YL1101却恢复了子实体的形成能力,并且菌株的孢子形成能力明显高于其他拷贝pilA基因的回补菌株。菌株混合发育实验的结果也表明,该回补菌株YL1101与具有相同遗传背景、但TFP不同的DK1622株菌在发育阶段存在着相互识别。另外,将回补菌株与TFP本源菌S.aurantiaca 17044混合发育之后,回补菌株YL1102、YL1103、YL1104均恢复了子实体的形成能力。推测,可能是S.aurantiaca 17044中存在着某类组分(如EPS等)能够与回补菌株形成的TFP相互作用,激发回补菌株的子实体形成。综上所述,S.aurantiaca 17044中存在有多个拷贝的pilA基因,但是这些pilA基因的功能却并不完全一致,其中pilA-1基因在菌株的发育和识别过程中起到重要作用。Hdsp,在前期工作中被证明是海洋耐盐粘球菌M.fulvusHW-1通过水平转移而来的外源基因,在陆地模式粘球菌中并不存在。hdsp基因插入失活使得突变株YLH0401的EPS产生能力、S运动能力、发育能力都有不同程度的降低甚至丧失,并且突变株在液体培养条件下由聚团生长转变成分散生长。为了研究M.fulvus HW-1中通过水平转移(HGT)获得的hdsp基因的功能发挥是否具有广泛性,本文尝试利用E. coli-M.xanthus穿梭载体pZJY41以及attP-attB位点特异性整合载体pSWU30为载体,将M.fulvus HW-1中的hdsp基因转移入陆地粘球菌研究的模式菌株M.xanthus DK1622中,通过RT-PCR的分析,确认hdsp基因能够在转化菌株中进行表达。对转化菌株的社会学行为进行研究,结果发现,包含有hdsp基因的DK1622转化菌株的胞外多糖EPS产生量提高,结合hdsp基因失活使得YLH0401社会学行为发生的变化,可以表明,hdsp基因可能在调控粘球菌EPS的产生过程中起到重要作用。生物信息学预测hdsp基因编码的Hdsp蛋白只包含有4个分散的TPR结构域,而TPR结构域在介导蛋白质互作中起到重要作用。为了进一步阐明hdsp基因在M.fulvus HW-1中的作用机制,找出与其相互作用的上下游组分,我们成功构建了基于表达载体pGEX-6P-1的截短Hdsp蛋白的表达载体,并在E. coli中通过优化条件,获得了只包含有TPR结构域的截短Hdsp蛋白的可溶性表达,纯化了GST-Hdsp蛋白分子,以Hdsp蛋白分子为诱饵,并通过GST-pulldown实验和后续的质谱鉴定,获得了在HW-1体内能够与Hdsp蛋白互作的蛋白分子信息,其中包含有若干重要的与胞外多糖EPS产生相关的蛋白组分,初步阐明了hdsp基因的作用机制。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-14
符号说明及缩写词  14-16
第一部分文献综述  16-43
  1.1 粘细菌的社会学行为  16-30
    1.1.1 粘细菌的运动  16-27
      1.1.1.1 粘细菌的A运动系统  18-19
      1.1.1.2 粘细菌的S运动系统  19-27
    1.1.2 粘细菌的捕食行为  27-28
    1.1.3 粘细菌的子实体形态发生及孢子形成  28-30
  1.2 海洋耐盐粘细菌的研究  30-34
    1.2.1 海洋耐盐粘细菌的发现以及对海洋生境的适应机制  30-31
    1.2.2 水平转移基因在HW-1社会学行为的维系以及适应海洋生境中的作用  31-34
  1.3 TPR结构域在介导蛋白质互作中的功能机制  34-39
    1.3.1 TPR结构域的结构特征  34-35
      1.3.1.1 TPR单体结构域的结构特征  34-35
      1.3.1.2 TPR结构域的多体形式  35
    1.3.2 TPR结构域的功能  35-37
    1.3.3 TPR结构域在脚手架蛋白中的作用机制  37-39
  1.4 粘细菌基因组中存在的多拷贝基因  39-42
  1.5 本论文工作开展思路和研究内容  42-43
第二章 S.aurantiaca 17044中多拷贝pilA基因功能的研究  43-74
  2.1 材料  44-48
    2.1.1 菌株与质粒  44-45
    2.1.2 培养基  45
    2.1.3 试剂  45-46
    2.1.4 仪器设备与耗材  46-48
  2.2 实验方法  48-60
    2.2.1 生物信息学分析及相关软件  48
    2.2.2 包含S.aurantiaca 17044不同pilA基因回补载体的构建流程  48-49
    2.2.3 目的片段的PCR扩增及连接  49-52
      2.2.3.1 引物设计及合成  49
      2.2.3.2 融合PCR  49-51
      2.2.3.3 片段与载体的连接、验证  51-52
    2.2.4 电转化以及阳性菌株的筛选  52-54
      2.2.4.1 电转化  52-53
      2.2.4.2 阳性菌株的系列稀释以及纯化  53
      2.2.4.3 粘球菌质粒的提取  53-54
    2.2.5 回补基因的表达分析  54-58
      2.2.5.1 反转录PCR(RT-PCR)  54-56
      2.2.5.2 Western blot检测回补菌株TFP的存在  56-58
    2.2.6 回补菌株的性质分析  58-60
      2.2.6.1 菌株的胞外多糖(EPS)产生能力的分析  58-59
      2.2.6.2 菌株的群体运动(S motility)能力分析  59
      2.2.6.3 菌株的发育能力分析  59
      2.2.6.4 菌株识别能力的分析  59-60
        2.2.6.4.1 营养生长阶段的菌落扩展实验  59-60
        2.2.6.4.2 菌株的混合发育实验  60
  2.3 实验结果  60-72
    2.3.1 多拷贝pilA基因的获得以及pZJY41-pilA载体构建结果  60-61
    2.3.2 S.aurantiaca 17044中PilA蛋白序列分析结果  61-62
    2.3.3 S.acurantiaca 17044中各拷贝pilA基因的表达分析  62-63
    2.3.4 各回补菌株中pilA基因的表达分析  63
    2.3.5 菌株的社会学行为分析  63-72
      2.3.5.1 菌株的胞外多糖EPS产生能力分析  63-64
      2.3.5.2 菌株S运动能力分析  64-65
      2.3.5.3 菌株的发育能力分析  65-66
      2.3.5.4 菌株的相互识别能力分析  66-72
        2.3.5.4.1 菌株在营养生长阶段的菌落扩展情况  66-68
        2.3.5.4.2 菌株在发育阶段的识别能力  68-72
  2.4 本章小结  72-74
第三章水平转移基因hdsp的功能机制研究  74-104
  3.1 材料  74-76
    3.1.1 菌株与质粒  74-76
    3.1.2 培养基  76
    3.1.3 试剂  76
    3.1.4 仪器设备与耗材  76
  3.2 实验方法  76-85
    3.2.1 hdsp基因以及编码的Hdsp蛋白的生物信息学分析  76-77
    3.2.2 相关载体的构建流程  77-80
      3.2.2.1 独立复制载体pZJY41-hdsp的构建  77-78
      3.2.2.2 位点特异性整合载体pSWU30-hdsp的构建  78-80
      3.2.2.3 表达载体pGEX-6P-1-truncated hdsp的构建  80
    3.2.3 目的片段的PCR扩增及连接  80-81
      3.2.3.1 引物设计及合成  80-81
      3.2.3.2 目的片段的PCR扩增、酶切以及回收  81
      3.2.3.3 片段与载体的连接、验证  81
    3.2.4 电转化以及阳性菌的筛选  81
    3.2.5 基因的存在以及表达分析  81-82
      3.2.5.1 菌落PCR  81-82
      3.2.5.2 反转录PCR(RT-PCR)  82
    3.2.6 菌株的社会学行为及生长情况分析  82
      3.2.6.1 菌株的胞外多糖(EPS)产生能力的分析  82
      3.2.6.2 菌株的群体运动(S motility)能力分析  82
      3.2.6.3 菌株的发育能力分析  82
      3.2.6.4 菌株的捕食能力分析  82
      3.2.6.5 菌株在液体培养条件下的生长情况分析  82
    3.2.7 目的基因在E.coli中的诱导表达  82-83
    3.2.8 利用亲和层析方法纯化蛋白  83-84
    3.2.9 利用离子交换层析方法纯化蛋白  84
    3.2.10 GST-pulldown实验状得与靶蛋白互作的蛋白分子  84-85
    3.2.11 质谱鉴定相互作用的蛋白  85
    3.2.12 GST-Hdsp融合蛋白中GST标签的去除  85
  3.3 实验结果  85-102
    3.3.1 hdsp基因以及编码的Hdsp蛋白的生物信息学分析  85-87
    3.3.2 相关载体的构建结果  87-91
      3.3.2.1 独立复制载体pZJY41-hdsp的构建结果  87-89
      3.3.2.2 位点特异性整合载体pSWU30-hdsp的构建结果  89-91
      3.3.2.3 异源表达载体pGEX-6P-1-hdsp的构建结果  91
    3.3.3 包含有hdsp基因转化菌株的社会学行为及生长情况分析  91-96
      3.3.3.1菌株的EPS产生能力分析  91-92
      3.3.3.2 菌株的S运动能力分析  92-93
      3.3.3.3 菌株的发育能力分析  93-94
      3.3.3.4 菌株的捕食能力分析  94-95
      3.3.3.5 菌株的聚团生长能力  95-96
    3.3.4 截短Hdsp蛋白在E.coli中的表达及条件优化  96-97
      3.3.4.1 GST-Hdsp蛋白表达的检测  96
      3.3.4.2 GST-Hdsp蛋白表达条件的优化  96-97
    3.3.5 GST-Hdsp蛋白的纯化  97-100
      3.3.5.1 亲和层析纯化GST-Hdsp融合蛋白  97-98
      3.3.5.2 离子交换层析纯化GST-Hdsp融合蛋白  98-99
      3.3.5.3 GST-Hdsp融合蛋白中GST标签的去除  99-100
    3.3.6 与Hdsp蛋白相互作用蛋白的信息  100-102
      3.3.6.1 GST-pulldown实验获得的相互作用蛋白  100
      3.3.6.2 质谱鉴定蛋白样品以及候选蛋白的筛选  100-102
  3.4 本章小结  102-104
总结与展望  104-106
附录  106-108
参考文献  108-118
致谢  118-119
攻读学位期间发表的论文  119-120
学位论文评阅及答辩情况表  120

多拷贝pilA基因功能暨水平转移基因hdsp作用机制的初步研究

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