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GFP转基因鼠神经上皮干细胞纹状体内移植的实验研究

作　者: 王家增
导　师: 孙晋浩
学　校: 山东大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 神经上皮干细胞 增殖分化 移植 GFP转基因鼠
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


背景:神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞,是神经系统的原始细胞,可以分化为神经元和神经胶质细胞,在体内和体外特定的微环境中均可诱导分化成特定递质类型的神经细胞。神经干细胞良好的生物学特性引起了众多神经科学研究者的研究兴趣,在神经移植领域,越来越多的研究表明,神经干细胞可以作为细胞替代治疗中良好的供体细胞,移植后可以替代退变或损伤的神经元,不同程度地恢复病变部位原有的功能,为发育不良性脑病及神经退行性疾病的治疗带来了希望。神经上皮干细胞（Neuroepithelial stem cell,NEP）起源于胚胎神经板和神经管,构成了神经系统的原基,是最原始的神经干细胞。我们实验室以前的研究以及最近的实验均表明神经上皮干细胞具有活跃的增殖能力,体内移植后可以分化为神经元及神经胶质细胞。在这些研究中,由于受到标记方法的限制,难以对移植细胞进行追踪观察和确认,对临床疗效的确定也缺乏有力的直接证据。绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）转基因鼠是将GFP基因融合到小鼠的遗传基因中,能够在小鼠的所有体细胞中长久而稳定的表达。从GFP转基因鼠胚胎神经管取材的GFP阳性神经上皮干细胞可以在荧光显微镜下检测到绿色荧光,体内移植后可方便、直观地区分供体细胞与宿主细胞,具有较高的灵敏度和分辨率。从GFP转基因鼠胚胎神经管取材神经上皮干细胞进行纹状体内移植的研究鲜有报道。目的以临床应用为最终目的的神经干细胞脑内移植的研究已成为干细胞研究中的一个热点。神经干细胞在移植部位能否长期存活、能否分化为所需要的神经元等问题是这一研究领域的难点。为检测和观察胚胎神经管来源的神经上皮干细胞脑内移植后存活及分化的情况,我们采用GFP转基因鼠的早期胚胎来源的神经上皮干细胞,经体外纯化、扩增后,定向移植到大鼠的纹状体内,术后不同时间取材、切片,在荧光显微镜下观察移植细胞的存活与分化状况,并与其体外自然分化状况相比较。从而为胚胎神经上皮干细胞纹状体内移植治疗帕金森病的可行性提供直观、确切的证据。方法将GFP转基因鼠胚胎神经管取材的神经上皮干细胞置于无血清培养基(成份:DMEM/F12+B27+bFGF,其中,B27:1:50;bFGF:10μg/ml)内进行纯化、扩增;用神经巢蛋白（nestin）染色进行神经干细胞的特异性鉴定;继而用含10%胎牛血清的干细胞分化培养液进行分化培养,体外培养7天后行微管相关蛋白（microtubule-associated protein-2,MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillaryacidic protein,GFAP）以及酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）特异性免疫细胞化学染色,以观察神经上皮干细胞在有血清培养中自然分化的趋向;将培养扩增后的含GFP基因的神经上皮干细胞在立体定位仪下定向移植到大鼠的纹状体内,术后不同时间取材、切片,在荧光显微镜下检测移植细胞的存活状况,行微管相关蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及酪氨酸羟化酶（TH）特异性免疫组织化学染色,以检测神经上皮干细胞在纹状体微环境内向多巴胺能神经元定向分化的状况,从而为神经上皮干细胞纹状体内移植治疗帕金森病的可行性提供实验依据。结果（1）GFP转基因鼠神经管来源的神经上皮干细胞在无血清培养基内培养24小时可见细胞分裂相,3天时可见数量较多、形体较小、呈悬浮生长的神经球,培养7天的培养瓶中神经球的数量增多、体积变大,直径可达100μm。经神经巢蛋白染色鉴定,增殖形成的神经球呈nestin阳性;（2）体外扩增的GFP转基因鼠的神经上皮干细胞在含10%胎牛血清的分化培养液内培养7天,可分化为神经元和神经胶质细胞,其中有少量的TH阳性细胞;（3）体外扩增后的GFP转基因鼠来源的神经上皮干细胞移植到纹状体内后存活良好。在术后2W的组织切片中,移植区内可见成片的绿色荧光细胞,部分细胞已经开始分化并向周围伸出突起,有些还迁移到移植区100μm以外的组织中;在术后4周的组织切片中,大部分移植细胞都进行了分化,胞体形态多样,大小不等,突起较长,细胞间已建立了连接。迁移出移植区的细胞多沿白质排成一列,前后相续。免疫组织化学染色表明部分细胞已经分化成神经元、神经胶质细胞,其中有相当多的细胞呈TH阳性,说明神经上皮干细胞在纹状体内能定向分化为多巴胺能神经元。结论GFP转基因鼠来源的神经上皮干细胞具有活跃的增殖能力和多向分化潜能;纹状体内移植后存活良好,并能向周围迁移,在纹状体局部微环境的诱导下可分化为多巴胺能神经元;移植细胞在荧光显微镜下易于检测。

全文目录


中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
符号说明  12-14
前言  14-17
实验材料  17-20
实验方法  20-28
结果  28-30
讨论  30-36
结论  36-37
附图  37-44
参考文献  44-49
致谢  49-50
发表论文  50-51
学位论文评阅及答辩情况表  51

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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