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杜氏盐藻六个藻种生化指标的研究以及D.Salina中ACCase Beta亚基的克隆

作　者: 梁秀芝
导　师: 杨志荣
学　校: 四川大学
专　业: 微生物学
关键词: 杜氏盐藻 生长曲线 油脂 叶绿素 多糖 Bradford法 乙酰辅酶A羧化酶 克隆
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


本论文通过扩大培养杜氏盐藻藻种进行研究。实验准确的记录了盐藻的生长周期并绘制成生长曲线，六个藻种细胞生长速度差异不大，均在大约140h后进入对数生长期，约210h后进入稳定期，这和其他报道一致。对六种盐藻的生化指标进行研究，结果表明：所研究的6种杜氏盐藻均含大量营养元素，Dunaliella parva油脂含量高达细胞干重的44.30％，Dunaliella salina油脂含量为细胞干重的12.47％。叶绿素的含量在19.7μg／ml到29.2μg／ml之间。同时采用3，5-2硝基水杨酸法测定杜氏盐藻细胞中的多糖含量，在对蛋白质含量的测定上与以往采用了同样的Bradford法，但对样品的处理方式不同，本研究直接以离心收集的湿藻细胞进行，迄今为止还没有这方面的报道。由于盐藻总脂含量较高，结合目前的研究热点：生物柴油，实验首次从D.salina中克隆了乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase，ACCase，EC 6.4.1.2）的Beta亚基。乙酰辅酶A羧化酶属于生物素包含酶（biotincontaining enzyme）的类型Ⅰ（typeⅠ）。乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）具有催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰辅酶A的羧化作用，是在脂肪酸合成和代谢中起重要作用的中间代谢物。ACCase包括不同的形式，被不同的基因编码，本试验选择油脂含量最少，但目前研究的最多的藻种Dunaliella salina进行乙酰辅酶A羧化酶Beta亚基的克隆。根据真核生物NP045833.1（chloroplast Chlorella vulgaris）、YP635822.1（chloroplast Oltmannsiellopsis viridis）、YP636254.1（chloroplast Pseudendoclonium akinetum）以及YP635920.1（plastid Helicosporidium sp.ex Simulium jonesii）等的ACCβ基因的氨基酸高度保守序列，设计一对简并引物，利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻（Dunaliella salina）细胞的总RNA，通过RT-PCR，得到的一段长为400bp左右的cDNA片段，该片段与其他物种的ACCB基因具有很高的相似性。在此基础上进行5’和3’RACE扩增盐藻ACCβ基因的末端，得到全长为1288bp的盐藻ACCβ基因，产物与T载体连接后转化至大肠杆菌Top10中，经筛选后测序，将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果表明在盐藻中所获得的该cDNA片段，核苷酸长度为1288bp，编码349个氨基酸，genebank登录号分别为EF363909，ABO33321.1，推导的氨基酸序列与下列物种的ACCβ基因进行同源性比较：NP045833.1（chloroplast Chlorella vulgaris）为84％、YP635822.1（chloroplast Oltmannsiellopsis viridis）为82％、YP636254.1（chloroplast Pseudendoclonium akinetum）为80％。乙酰辅酶A羧化酶是一多亚基的酶，本实验成功克隆的Beta亚基，对以后的研究奠定了坚实的基础。

全文目录


目录  4-7
表目录  7-8
图目录  8-9
摘要  9-11
英文摘要  11-13
引言  13-18
第一章 六种盐藻生化指标的研究  18-26
  1 材料和方法  18-20
    1.1 材料  18-19
    1.2 方法  19-20
      1.2.1 细胞生长测定  19
      1.2.2 藻细胞的收集  19
      1.2.3 油脂的测定  19-20
      1.2.4 叶绿素的测定  20
      1.2.5 多糖的测定  20
      1.2.6 蛋白质的测定  20
  2 结果与讨论  20-25
    2.1 藻细胞的生长曲线  20-21
    2.2 收集的藻细胞  21-22
    2.3 六种杜氏盐藻中油脂、叶绿素、总糖、总蛋白的含量结果  22-25
      2.3.1 六种杜氏盐藻的油脂含量测定结果  22-23
      2.3.2 六种杜氏盐藻的叶绿素含量  23-24
      2.3.3 六种杜氏盐藻的总糖含量  24
      2.3.4 六种杜氏盐藻的蛋白质含量  24-25
  3 讨论  25-26
第二章 D.salina ACCase Beta亚基的克隆与序列分析  26-41
  1 材料  26-27
    1.1 研究用藻种、工程菌和克隆载体  26
    1.2 研究用试剂盒、工具酶和其他试剂  26
    1.3 主要仪器  26
    1.4 引物合成和测序  26-27
  2 方法  27-33
    2.1 盐藻ACCase Beta基因cDNA的克隆  27-32
      2.1.1 盐藻细胞的培养  27
      2.1.2 简并引物的设计  27
      2.1.3 盐生杜氏藻总RNA的提取  27-28
      2.1.4 反转录cDNA的制备  28-29
      2.1.5 盐藻ACC Beta subunit基因cDNA片段RT-PCR扩增  29
      2.1.6 PCR产物的纯化  29-30
      2.1.7 感受态细胞的制备  30-31
      2.1.8 连接反应及转化  31
      2.1.9 阳性克隆菌株的筛选及鉴定  31-32
      2.1.10 杜氏盐藻ACCase Beta亚基 基因cDNA片段的测序分析和序列比对  32
    2.2 RACE  32-33
      2.2.1 3'RACE  32-33
      2.2.2 5'RACE  33
      2.2.3 基因全长的获得  33
      2.2.4 盐藻ACCase Beta亚基的生物信息学预测  33
  3 结果  33-40
    3.1 杜氏盐藻RNA纯度及质量鉴定  33-34
    3.2 RT-PCR扩增杜氏盐藻ACCase Beta亚基基因的cDNA片段  34-35
    3.3 杜氏盐藻ACCase Beta亚基cDNA片段的同源性分析  35
    3.4 盐生杜氏藻ACC Beta亚基全长cDNA的获得  35-40
  4 讨论  40-41
第三章 盐藻和乙酰辅酶A羧化酶的研究综述  41-56
  1 盐藻的生物学特性  41-45
    1.1 形态特征  41-42
    1.2 盐藻细胞的生活史  42-43
    1.3 分布与分类  43
    1.4 盐藻的生理生化特征  43-44
    1.5 盐藻的细胞组成  44-45
  2 环境因子对盐藻生长的影响  45-49
    2.1 盐度  45-47
    2.2 温度和PH  47
    2.3 光照  47-48
    2.4 主要的营养条件  48-49
      2.4.1 碳源  48
      2.4.2 氮源和磷源  48-49
      2.4.3 其他元素  49
  3 盐藻的营养学研究  49
  4 盐藻的养殖  49-50
  5 乙酰辅酶A羧化酶的生物学特性  50-56
    5.1 乙酰辅酶A羧化酶的类型及分布  50-52
      5.1.1 异质型ACCase  51
      5.1.2 同质型ACCase  51-52
    5.2 乙酰辅酶A羧化酶的功能与调节  52-54
      5.2.1 在光诱导下ACCase调节脂肪酸的合成  53-54
      5.2.2 ACCase是脂肪酸合成反馈调节的作用位点  54
    5.3 乙酰辅酶A羧化酶的基因工程  54-56
      5.3.1 抗AOPPs和CHDs除草剂基因工程  54
      5.3.2 提高植物种子含油量基因工程  54-55
      5.3.3 提高藻类油脂含量基因工程  55-56
结论与展望  56-57
参考文献  57-63
致谢  63-64
作者在学期间取得的学术成果  64

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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