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高灵敏度电化学发光方法在植物病毒和转基因物种检测中的应用

作　者: 唐亚兵
导　师: 邢达
学　校: 华南师范大学
专　业: 光学
关键词: 电化学发光 PCR 35S启动子植物病毒转基因物种生物条形码杂交
分类号: S188
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

植物病毒是造成植物病害的主要病原物之一，每年因植物病毒造成的损失在数百亿美元。近年来，随着各国间贸易往来的日趋频繁以及植物种苗等繁殖材料的相互引入，使得植物病毒在全球范围内大面积传播，给人类的粮食生产带来了巨大的威胁，更严重威胁到人类的生存与发展。由于目前科学技术水平和研究能力还不能精确对各种带病植物体进行检测和消灭，因此发展一种高灵敏度的，快速简单的植物病毒检测方法成了当今科学研究的热门话题。目前植物病毒的检测方法很多，归纳起来主要是ELISA法和PCR法，但都存在着一些不足之处。ELISA法检测植物病毒时，因蛋白质容易热变性，另外，EHSA法的灵敏度较低，而且耗力耗时；普通PCR法是特异性扩增植物病毒中的保守核酸序列，通过凝胶电泳，从而达到检测的目的，此法比ELISA法灵敏度高，但是容易产生非特异性扩增和假阳性结果，而且电泳中所使用的溴化乙锭(ethidium bromide，EB)对操作人员有毒害作用。电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)分析方法是90年代初发展起来的一种极高灵敏度的检测方法，它巧妙地将电化学方法与化学发光结合于一体，利用三联吡啶钌与三丙胺在电极表面发生氧化还原反应而产生高效，稳定地发光，具有简单、快速、灵敏度高、适用性广等特点，已经广泛应用于免疫检测和药物分析中。实验中首次将聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)与电化学发光分析方法结合起来，并用于植物病毒检测。检测过程中采用生物素标记的探针与PCR产物杂交，可起到筛选特异性产物的作用，进而避免假阳性结果的产生。三联吡啶钌标记探针与PCR产物杂交，既可以起到进一步筛选目的片段的作用，又可与分析液中的三丙胺反应，产生光信号，从而被电化学发光仪所检测到。在两条引物的5’端分别连接一段特异性核酸序列，既提高了钌探针与特异性产物的杂交几率，又增强了样品检测信号，从而提高了信噪比。用该方法检测了以上样品，实验结果表明：该方法可以从植物样品中准确地，高灵敏毒地检测到病毒成分的存，且灵敏度高、稳定性好、操作简单，克服了病毒检测过程中普遍存在的灵敏度低，特异性低等问题。该方法的建立，无疑将对动、植物病毒的早期诊断，切断感染源和控制其传播都有着重大的意义。自从上个世纪80年代PCR方法被创立以来，它给分子生物学的研究带来了革命性的改变，PCR技术的高灵敏性也使医学检测，基因研究等得到飞速的发展。但是，PCR技术的本身也存在找一些缺点，方法复杂，需特殊的仪器，费时，易出现假阳性的结果。许多人都在寻求一种即可避免PCR方法的缺点，又能达到PCR的灵敏度的新方法，Mirkin等人于2002年发明了一种基于纳米金的生物条形码方法，该方法不需任何扩增而可以直接检测核酸。在Mirkin的基础上，本文发展了一种基于电化学发光的生物条形码方法，其充分利用了电化学发光的高灵敏性，纳米金与巯基修饰的核酸的共价结合力以及核酸杂交的高特异性，该方法简单、快速、避免了多重的杂交和洗脱过程，不需要任何扩增步骤，可以准确地从原始植物样品中探测出转基因成分的存在。

全文目录

中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一章绪论  13-25
  1.1 植物病毒的科学发展与研究进展  13-17
    1.1.1 植物病毒发现和研究历史  13-14
    1.1.2 植物病毒的传播与传染  14
    1.1.3 植物病毒危害  14-15
    1.1.4 植物病毒检测技术的发展  15-17
  1.2 转基因物种的研究进展  17-19
    1.2.1 转基因物种的简介  17
    1.2.2 转基因物种的安全性  17-18
    1.2.3 目前主要的检测方法  18-19
  1.3 电化学发光的研究进展  19-25
    1.3.1 电化学发光的基本原理  19
    1.3.2 电化学发光的特点  19-20
    1.3.3 主要的电化学发光类型  20-22
    1.3.4 电化学发光核酸分析方法  22-23
    1.3.5 电化学发光在生物分析中的应用  23-24
    1.3.6 电化学发光分析方法展望  24-25
第二章实验仪器装置  25-29
  2.1 实验装置的介绍  25-26
  2.2 实验装置的主要结构单元  26-29
    2.2.1 电化学发光反应部分  26
    2.2.2 光子探测部分  26-27
    2.2.3 数据采集部分  27-29
第三章电化学发光PCR方法检测植物病毒  29-45
  3.1 材料与方法  29-38
    3.1.1 材料  29-31
    3.1.2 方法  31-37
    3.1.3 实验原理  37-38
  3.2 结果  38-43
    3.2.1 杂交条件对电化学发光的影响  38-39
    3.2.2 磁珠的量对电化学发光的影响  39-40
    3.2.3 电化学发光检测系统性能测试  40
    3.2.4 电化学发光检测RNA病毒  40-42
    3.2.5 电化学发光检测DNA病毒  42-43
    3.2.6 电泳分析验证PCR产物  43
  3.3 讨论  43-45
第四章基于电化学发光的生物条形码方法检测转基因物种  45-59
  4.1 引言  45-46
    4.1.1 纳米金粒子的简介  45
    4.1.2 方法的特点  45-46
  4.2 材料与方法  46-53
    4.2.1 材料  46-47
    4.2.2 方法  47-53
  4.3 实验原理  53-54
  4.4 结果与讨论  54-59
    4.4.1 探针的浓度比对电化学发光的影响  54-55
    4.4.2 磁珠的量对电化学发光的影响  55-56
    4.4.3 检测纯化转基因样品  56
    4.4.4 定量检测转基因样品  56-57
    4.4.5 直接检测转基因原始样品  57-59
第五章总结  59-60
参考文献  60-70
完成论文  70-71
致谢  71-72

高灵敏度电化学发光方法在植物病毒和转基因物种检测中的应用

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