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牛型分枝杆菌四种特异性蛋白嵌合体在诊断中的应用

作　者: 吴波
导　师: 陈焕春；郭爱珍
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医
关键词: iELISA 融合蛋白牛结核病 MPB70 MPB83 CFP10 ESAT-6
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

牛结核病（bovine tuberculosis，bTB）是主要由牛型分枝杆菌（Mycobacterium bovis）感染引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病，其中奶牛为最易感动物。伴随我国奶业的快速发展，我国奶牛结核病近年来蔓延全国，不仅阻碍着我国奶业的可持续发展，而且严重威胁食品安全和公共卫生。1．牛型分枝杆菌cfp10-esat-6融合基因的克隆及表达应用PCR方法从牛分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得cfp-10和esat-6四个目的基因片段，通过引入一段Linker序列构建cfp10-esat-6融合基因；并且克隆入表达质粒pET-28a（+）。经测序确认，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，成功表达了具有良好抗原性的CFP10-ESAT-6 融合蛋白。2．牛型分枝杆菌MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白的表达应用PCR方法从牛型分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得mpb70、mpb83、cfp10和esat-6四个目的基因片段，测序鉴定序列的正确性。采用重叠延伸剪接技术（splicing by overlap extension，SOE）获得融合基因cfp10-esat-6和mpb83-cfp10-esat-6，将mpb70和mpb83-cfp10-esat-6串连于载体pUC19-Link上，再将mpb70-mpb83-cfp10-esat-6连于表达载体pET28a（+）中得到重组质粒pET-28a-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6。转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，经IPTG诱导获得可溶性表达的融合蛋白。用Ni⁺⁺亲合层析柱纯化该融合蛋白。ELISA及Western blot鉴定融合蛋白的免疫活性，热处理法分析蛋白的热稳定性。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CFP10-ESAT-6的多抗反应，说明该融合蛋白具有单个抗原的免疫学活性。Western blot分析显示，该融合蛋白能与抗牛型分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与其它非相关抗原的阳性参考血清如牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清等不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白为一种热稳定性好的蛋白。通过基因工程融合表达了牛型分枝杆菌的四种特异性抗原蛋白，该蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性，作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。3．牛结核病ELISA抗体检测方法的临床应用大肠杆菌原核表达MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合抗原，进行纯化与鉴定后，以此为诊断抗原建立了牛结核病间接ELISA抗体检测（iEHSA）的诊断方法。数据结果用血清样本与阳性对照和阴性对照的OD₆₃₀相对值（S／P）表示，用90份健康牛血清检测结果确定阴阳性临界值S／P为0.17。iELISA与常见非相关牛病的参考阳性血清无交叉反应。以结核菌素皮肤试验（TST）为参考方法，检测了华中地区四个奶牛场的560头黑白花奶牛。在所检测的560份血清中，iELISA阳性105份，阴性455份；TST阳性76份，阴性484份；两种方法共同检出阳性样本55份，共同检出阴性样本434份，总符合率为87.32％。以TST为金标准，则iELISA的敏感性为72.37％（55／76），特异性为89.67％（434／484）。另外，又用iELISA、胶体金试纸条（CGST）和细菌培养平行检测了其中150头黑白花奶牛。iELISA与CGST的符合率为93.33％（140／150），采集其中22头奶牛鼻拭子分菌培养，iELISA与细菌培养的符合率为77.27％（17／22）。对这22头皮试阳性牛进行跟踪检测，第一次检测抗体阳性率为36％（8／22），7个月后再次采样，22头阳性牛中有6头已被淘汰，其余16头抗体检测均为阳性，检出率为100％（16／16），表明牛型分枝菌感染诱导的体液免疫反应滞后于细胞免疫反应。检测来自湖北武汉地区和宜昌地区共计1014份血清样品，其中阳性167份，阴性血清847份，总体阳性率为16.47％。不同牛场间阳性率差异很大，从0％～65％不等。总体上小型养殖场（＜100头）阳性率较高，部分奶牛场结核污染严重；大型养殖场阳性率较低。进一步检测了来自于中国30个省市的1344份奶牛血清，结果表明牛型分枝杆菌血清抗体阳性率平均为1.60％，范围从0％-20％，表明牛型分枝菌感染呈现地方流行性趋势。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词(Abbreviation)  10-11
第1章文献综述  11-22
  1.1 结核分枝杆菌的细菌学与基因组特征  11-13
    1.1.1 细菌学特征  11-12
    1.1.2 基因组特征  12-13
  1.2 结核分枝杆菌蛋白质抗原分研究概况  13-14
    1.2.1 全菌菌体蛋白质  13-14
    1.2.2 膜蛋白(脂蛋白成分)  14
    1.2.3 分泌蛋白  14
  1.3 细菌蛋白的免疫学研究进特征  14-16
    1.3.1 菌体蛋白类  14-15
    1.3.2 分泌蛋白类  15
    1.3.3 其它相关重要蛋白  15-16
  1.4 主要蛋白抗原的特性  16-19
    1.4.1 CFP系列蛋白  16
    1.4.2 ESAT-6家族蛋白  16-17
    1.4.3 MPB系列蛋白  17-18
    1.4.4 抗原85复合蛋白质(Ag85)  18-19
    1.4.5 DnaK、GroEL、GroES蛋白  19
    1.4.6 脂蛋白  19
  1.5 结核分枝杆菌特异性抗原  19-22
    1.5.1 在人体中的研究  20-21
    1.5.2 在牛中的研究  21-22
第2章牛型分枝杆菌cfp10-esat-6融合基因的克隆及表达  22-35
  2.1 研究目的和意义  22
  2.2 材料与方法  22-29
    2.2.1 材料  22-25
    2.2.2 方法  25-29
  2.3 结果与分析  29-33
    2.3.1 pET-28a-CFP10-ESAT-6的克隆  29-31
    2.3.2 重组质粒的双酶切鉴定  31
    2.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析  31-33
  2.4 讨论  33-34
    2.4.1 pET-28a-CFP10-ESAT-6重组质粒的构建  33
    2.4.2 CFP10和ESAT-6蛋白的生物学性质  33
    2.4.3 CFP10-ESAT-6融合蛋白的诊断应用研究  33-34
  2.5 小结  34-35
第3章牛结核病四种蛋白嵌合体抗体ELISA  35-44
  3.1 研究目的和意义  35
  3.2 材料与方法  35-37
    3.2.1 材料  35-36
    3.2.2 方法  36-37
  3.3 结果  37-44
    3.3.1 临界值的确定  37
    3.3.2 iELISA的交叉反应检测  37
    3.3.3 iELISA与TST的结果比较  37-38
    3.3.4 iELISA与胶体金试纸条商品试剂盒检测的结果比较  38
    3.3.5 iELISA与细菌分离培养的结果比较  38-39
    3.3.6 湖北武汉和宜昌地区流行病学调查  39-40
    3.3.7 全国30个省市流行病学调查  40-44
参考文献  44-51
致谢  51-52
附录  52-55
硕士期间发表论文及研究成果  55

牛型分枝杆菌四种特异性蛋白嵌合体在诊断中的应用

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