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表达结核分支杆菌Ag85B抗原重组牛布鲁氏菌S19疫苗株的构建

作　者: 刘林涛
导　师: 步志高
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛布鲁氏菌病牛结核病 S19-ag85b ag85b基因 Ag85B抗原
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 67次
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内容摘要

布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏菌(brucella)引起的一种全球性流行的人畜共患病。布鲁氏菌感染宿主广泛,目前已知宿主包括60多种家畜、禽及野生动物。B.abortus感染牛后主要引起母畜的流产、死胎、弱仔。牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的另一种人兽共患的慢性消耗性传染病,可引起乳房炎,结核性胸膜炎,产乳率和乳质下降等症状。奶牛最为易感。结核病病牛是本病的主要传染源。牛布鲁氏菌病和牛结核不仅造成巨大经济损失,而且可以成为人类的感染源,构成严重公共卫生危害。免疫接种是预防牛布鲁氏菌病的重要手段。B.abortus S19疫苗株长期应用于牛布鲁氏菌的免疫防制,其安全性和有效性得到充分证明。牛结核一直缺乏有效防制疫苗,其防控主要依赖被动的扑杀淘汰。近年来的研究进展表明,结核分支杆菌胞壁蛋白Ag85B抗原免疫动物可诱导有效保护性免疫反应。布鲁氏菌与结核分支杆菌均为间性胞内寄生的病原菌,二者致病与免疫反应机制相似;两种传染病经常共同持续感染牛群,特别是在发展中国家和边远落后地区。bp26基因是布鲁氏菌基因缺失标记疫苗的候选靶标。bp26基因的缺失突变不影响疫苗的免疫保护效率,但其诱导的免疫反应可以通过血清学方法与自然感染相区别。为此,本研究以bp26基因作为重组靶位点,将牛结核分支杆菌ag85b基因的开放阅读框和卡那抗性基因(筛选基因)同源重组到S19疫苗株的基因组中,取代bp26基因,筛选出双交叉插入外源目的基因的重组疫苗株S19-ag85b。Western blot结果显示Ag85B抗原蛋白在重组疫苗株获得正确表达。该重组疫苗株在连续含有卡那霉素的TSA-YE平板上传20代,仍保持ag85b基因稳定遗传和表达。重组疫苗株S19-ag85b与S19疫苗株分别以108CFU菌量腹腔途径菌株接种4-6周龄BALB/c小鼠,分别于接种后第1,3,6,9,12,15周扑杀小鼠,称量脾脏重量并检测脾脏荷菌情况。结果显示,随着时间推移,S19-ag85b和S19在小鼠脾脏内的数量持续减少,二者的荷菌量及消减趋势基本吻合,分别于15周左右基本清除。结果表明,S19-ag85b保持S19的低致病性生物安全特性。进一步对重组疫苗株与野生疫苗株进行免疫保护效力的比较试验。S19-ag85b和S19分别以105CFU剂量接种4-6周龄BALB/c小鼠。免疫后6周,分别以马耳他种M28强毒株104CFU菌量和牛种544强毒株5×104CFU菌量,通过腹腔接种途径对免疫小鼠进行攻击试验。分别于攻毒后15扑杀小鼠,称量脾脏重量并检测脾脏荷菌情况。结果显示,无论M28还是544攻击后,S19-ag85b和S19免疫鼠之间脾脏重量及荷菌量均无显著差异,但都显著低于PBS接种对照小鼠。结果表明,重组疫苗株S19-ag85b保持S19疫苗的免疫保护效力。本研究为牛布鲁氏菌病和结核的重组二联新型疫苗的探索研究奠定了初步的基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章绪论  13-30
  1.1 布鲁氏菌病研究进展  13-24
    1.1.1 病原学  13
    1.1.2 传染病学  13-15
    1.1.3 临床症状  15
    1.1.4 布鲁氏菌病的诊断  15-18
    1.1.5 布鲁氏菌疫苗研究进展  18-23
    1.1.6 免疫株S19 作为疫苗载体的理论依据  23-24
  1.2 结核菌病研究进展  24-28
    1.2.1 概述  24
    1.2.2 传染病学  24-25
    1.2.3 潜伏期  25
    1.2.4 临床症状  25
    1.2.5 结核疫苗研究进展  25-28
    1.2.6 Ag85B 蛋白的特性  28
  1.3 本研究的目的与意义  28-30
第二章材料与方法  30-39
  2.1 材料  30-31
  2.2 方法  31-39
    2.2.1 引物的设计与合成  31
    2.2.2 布鲁氏菌S19 基因组的提取  31
    2.2.3 同源重组质粒左右同源臂、ag85b基因、卡那霉素抗性基因的扩增  31-33
    2.2.4 PCR产物的回收及纯化  33
    2.2.5 回收产物的连接  33
    2.2.6 连接产物的转化  33
    2.2.7 目的质粒的提取  33-34
    2.2.8 重组质粒pSP-bp26-ag85b-k的构建  34-35
    2.2.9 S19-ag85b 重组株的构建  35
    2.2.10 重组疫苗株S19-ag85b的筛选  35-36
    2.2.11 重组疫苗株S19-ag85b的PCR鉴定  36
    2.2.12 重组疫苗株S19-ag85b稳定性的鉴定  36
    2.2.13 重组疫苗株S19-ag85b的Western Blot 鉴定  36-37
    2.2.14 重组疫苗株 S19-ag85b 和亲本株 S19 冻干保存  37-38
    2.2.15 重组疫苗株S19-ag85b在小鼠体内安全性试验  38
    2.2.16 重组疫苗株S19-ag85b在小鼠体内的短期保护试验  38-39
第三章实验结果  39-49
  3.1 左右同源臂、卡那霉素抗性基因及ag85b基因的扩增及鉴定  39-40
    3.1.1 同源臂的PCR扩增及鉴定  39
    3.1.2 卡那霉素抗性基因和 ag85b 基因的 PCR 扩增及鉴定  39-40
  3.2 同源重组质粒 pSP-bp26-ag85b-k 的酶切鉴定  40-41
  3.3 重组疫苗株S19-ag85b的PCR鉴定  41-43
    3.3.1 卡那霉素抗性基因的PCR鉴定  41-42
    3.3.2 氨苄霉素抗性基因的PCR鉴定  42
    3.3.3 bp26 基因的PCR鉴定  42-43
    3.3.4 ag85b基因的PCR鉴定  43
  3.4 重组疫苗株S19-ag85b Western Blot鉴定  43-45
    3.4.1 Ag85B 蛋白诱导条件的确定  43-44
    3.4.2 Ag85B 蛋白的纯化  44-45
    3.4.3 重组疫苗株S19-ag85b Western Blot鉴定  45
  3.5 重组疫苗株S19-ag85b在小鼠体内安全性试验测定结果  45-46
  3.6 重组疫苗株S19-ag85b的小鼠短期免疫保护试验的测定结果  46-49
第四章讨论  49-51
  4.1 重组疫苗株S19-ag85b的构建策略  49
  4.2 重组疫苗株S19-ag85b的PCR鉴定  49
  4.3 重组疫苗株S19-ag85b的小鼠短期免疫保护试验  49
  4.4 重组疫苗株S19-ag85b在小鼠体内安全性试验  49-50
  4.5 展望  50-51
第五章结论  51-52
参考文献  52-63
致谢  63-64
作者简历  64

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