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牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究

作　者: 刘磊
导　师: 姜秀云
学　校: 吉林农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 牛分枝杆菌 SOE-PCR 融合蛋白 MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B ELISA
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人和动物共患的慢性消耗性传染病,被我国列为二类动物疫病。近年来,该病不仅没有得到有效控制,而且流行情况呈上升趋势,严重地威胁和危害着畜牧业的发展以及人类的健康。MPB51、MPB63、MPB83和Ag85B都是结核分枝杆菌的主要保护性抗原。都在牛结核病血清学诊断中具有很大的潜力,是作为牛结核病亚单位疫苗及核酸疫苗很好的候选抗原。1.牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因的获得以重组质粒pMD-18-T-51-63和pGEM-T-83、pGEM-T-85b为模板采用PCR技术扩增mpb51-63、mpb83和ag85b目的基因片段。以mpb83和ag85b基因片段为模板,采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlapping extension polymerase chain reaction,SOE PCR)扩增mpb83-85b融合基因。再以mpb51-63和mpb83-85b为模板,通过SOE PCR(?)mpb51-63和mpb83-85b基因融合,获得了融合基因mpb51-63-83-85b。2.牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因的表达将mpb51-63-83-85b基因片段和表达载体pET30a(+)进行NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切,回收纯化酶切产物,并用T4 DNA连接酶连接,成功地构建了原核表达重组质粒pET30a-51-63-83-85b。将该重组表达质粒转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经过IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约100 kDa的外源蛋白表达,Western blotting分析发现,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B具有牛分枝杆菌抗原反应性。该融合蛋白通过离子交换层析得到了纯化。为进一步研究融合基因mpb51-63-83-85b及其表达产物作为核酸疫苗、亚单位疫苗和新型的诊断抗原,以及建立牛结核病特异、敏感的诊断方法奠定了基础。3.融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B在牛结核病ELISA检测中的初步应用以纯化的融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B为诊断抗原,以94份健康牛血清的检测结果确定阴、阳性临界值,从而建立了牛结核病间接ELISA检测方法。通过对牛结核阴性、阳性血清及副结核阳性血清的检测结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性。通过283份待检血清检测结果显示,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B的阳性检出率为5.30%(15/283),PPD的阳性检出率为6.36%(18/283),两者的阳性符合率为83.33%。初步研究结果表明,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B作为牛结核病ELISA诊断抗原具有较好的敏感性和特异性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一部分综述  9-22
  1 结核病的危害  9
  2 病原  9-10
  3 流行病学  10-12
  4 致病机理  12
  5 免疫机理  12-13
  6 牛结核病诊断技术研究进展  13-17
  7 牛分枝杆菌主要保护性抗原研究进展  17-20
  8 牛结核DNA疫苗的研究现状  20-21
  9 本研究的目的和意义  21-22
第二部分实验内容  22-60
  实验一牛分枝杆菌MPB51-MPB63-MPB83-Ag85b融合蛋白的表达及纯化  22-53
    1 引言  22
    2 材料与方法  22-36
      2.1 材料  22-26
      2.2 方法  26-36
    3 结果  36-50
      3.1 目的基因的PCR扩增产物  36-40
      3.2 原核表达质粒的构建  40
      3.3 重组表达质粒的鉴定  40-42
      3.4 目的基因的序列测定与分析  42-46
      3.5 SDS-PAGE分析  46-47
      3.6 Western blot分析  47
      3.7 重组蛋白的纯化结果分析  47-50
    4 讨论  50-52
      4.1 目的基因的选择  50
      4.2 关于融合基因的构建  50-51
      4.3 原核表的系统的选择  51
      4.4 融合蛋白的反应性  51
      4.5 关于融合蛋白的纯化  51-52
    5 小结  52-53
  实验二 MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B在牛结核病ELISA检测中的初步应用  53-60
    1 引言  53
    2 材料与方法  53-55
      2.1 材料  53-54
      2.2 方法  54-55
    3 结果  55-58
      3.1 MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B融合蛋白最适包被浓度和血清最适稀释浓度的确定  55-56
      3.2 酶标抗体的工作浓度的确定  56
      3.3 ELISA判定标准的确定  56-57
      3.4 特异性检测结果  57
      3.5 敏感性检测结果  57
      3.6 待测血清检测结果  57-58
    4 讨论  58-59
    5 小结  59-60
第三部分结论  60-61
参考文献  61-68
缩略语表  68-69
致谢  69-70
作者简介  70

牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究

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