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牛分枝杆菌融合蛋白的表达及其在IFN-γ释放试验中的应用

作　者: 郝辉
导　师: 朱鸿飞
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛结核病 ESAT-6 MPB63 HSP65 HSP70 融合蛋白 IFN-γ
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


牛结核病(Bovine tuberculosis)是一种人兽共患传染病,主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)引起,被国际兽疫局(OIE)列为二类传染病,该病的流行与传播不仅严重地影响着畜牧业的持续发展,也严重威胁着人类的生命与健康。传统的牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives, PPD)皮内变态反应试验存在主观性强、耗时、耗力、特异性差、近期受感染牛体敏感性很低等方面的缺点。γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)释放实验是目前最有前景的诊断方法之一,且已有商品化的试剂盒提供,但由于采用牛PPD作为刺激原,导致诊断结果的假阳性率偏高,特异性较低,因此,寻找新的特异性刺激原来改进牛结核病诊断方法势在必行。本研究克隆了牛分枝杆菌的4个主要保护性抗原基因并构建重组表达质粒,以融合表达的蛋白作为刺激原,以期在保证IFN-γ诊断方法的敏感性的同时提高其特异性。本研究以M.bovis Vallee III基因组DNA为模版,用ESAT-6、MPB63、HSP65和HSP70的特异性引物进行PCR扩增,分别扩增出288 bp、480 bp、1623 bp和1878 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物纯化后克隆至pEASY-T1 cloning Vector中,以质粒酶切鉴定及序列分析鉴定重组克隆,成功获得重组质粒pEASY-T-E6、pEASY-T-M63、pEASY-T-H65和pEASY-T-H70。序列测定分析表明,获得的四个基因的序列与GenBank中发布的序列完全相同。将ESAT-6、MPB63和HSP65以及ESAT-6、MPB63和HSP70定向克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒,分别命名为pET-E6-M63-H65和pET-E6-M63-H70,测序结果表明,两重组质粒含有ESAT-6、MPB63、HSP65或ESAT-6、MPB63、HSP70的完整读码框序列。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明,表达产物大小分别为108kD和116kD,与预期大小一致,将2种重组融合蛋白分别命名为ESAT-6-MPB63-HSP65融合蛋白和ESAT-6-MPB63-HSP70融合蛋白,分析结果表明,这两种融合蛋白均以可溶形式表达。用HisLink? Protein Purification Resin及蛋白纯化柱纯化目的蛋白,进行SDS-PAGE分析,结果显示纯化后的目的蛋白均为单一条带。以结核病牛阳性血清作为一抗进行Western blotting分析,结果显示能发生特异性结合,表明所表达的目的蛋白均具有牛分枝杆菌的抗原性。用纯化后的ESAT-6-MPB63-HSP65融合蛋白和ESAT-6-MPB63-HSP70融合蛋白作为刺激原与待检牛全血孵育24 hr后检测上层血浆中的IFN-γ的表达水平,以判定待检牛是否感染牛分枝杆菌。结果显示,ESAT-6-MPB63-HSP65融合蛋白和ESAT-6-MPB63-HSP70融合蛋白分别作为刺激原的IFN-γ释放试验方法的检测特异性均达到100 %。但由于试验条件所限,敏感性分析数据尚不充分,有待进一步补充完善。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章 绪论  13-20
  1.1 牛结核病的危害  13
  1.2 流行病学  13-15
    1.2.1 发达国家的流行状况  13-14
    1.2.2 发展中国家的流行状况  14
    1.2.3 我国的流行状况  14-15
  1.3 牛结核病的诊断  15-17
    1.3.1 结核菌素皮内试验  15
    1.3.2 血清学诊断  15-16
    1.3.3 对菌体成分的检测  16
    1.3.4 聚合酶链反应(PCR 技术)  16
    1.3.5 核酸探针技术  16
    1.3.6 γ-干扰素释放试验  16-17
  1.4 牛分枝杆菌蛋白质抗原的研究  17-18
    1.4.1 热休克蛋白  17
    1.4.2 MPB 系列蛋白  17-18
    1.4.3 ESAT-6 家族蛋白  18
    1.4.4 Ag85 复合物  18
  1.5 牛结核病的防控策略  18-20
第二章 牛分枝杆菌 ESAT-6、MPB63、HSP65 和 HSP70 基因的克隆及串联表达  20-37
  2.1 实验材料  20-23
    2.1.1 菌株和载体  20
    2.1.2 主要试剂  20
    2.1.3 试验所用溶液及配置  20-22
    2.1.4 主要仪器设备  22-23
  2.2 方法  23-32
    2.2.1 重组质粒构建策略  23-26
    2.2.2 表达盒特性  26
    2.2.3 牛分枝杆菌基因组 DNA 的提取  26
    2.2.4 引物的设计  26-27
    2.2.5 目的基因的 PCR 扩增与产物回收  27-28
    2.2.6 连接到pEASY-T1 载体  28
    2.2.7 感受态细胞的制备  28
    2.2.8 转化  28
    2.2.9 质粒的小量提取（碱裂解法）  28
    2.2.10 质粒的试剂盒提取  28-29
    2.2.11 阳性克隆的酶切鉴定、测序鉴定  29
    2.2.12 3 基因串联重组质粒的构建与鉴定  29-31
    2.2.13 重组质粒的诱导表达  31
    2.2.14 表达产物的检测（SDS-PAGE）  31-32
    2.2.15 目的蛋白的可溶性分析  32
  2.3 结果与分析  32-35
    2.3.1 PCR 扩增目的基因  32-33
    2.3.2 目的基因连接到pEASY-T1 载体的酶切鉴定  33
    2.3.3 pEASY-T-E6、pEASY-T-M63、pEASY-T-H65 和 pEASY-T-H70 序列测定结果  33
    2.3.4 3 基因串联到pET-32a(+)载体的酶切鉴定及序列测定结果  33-34
    2.3.5 pET-E6-M63-H65、pET-E6-M63-H70 质粒的原核表达  34
    2.3.6 目的蛋白的可溶性分析  34-35
  2.4 讨论  35-37
第三章 融合蛋白的分离纯化  37-43
  3.1 材料与方法  37-38
    3.1.1 主要试剂耗材  37
    3.1.2 试验所用溶液及配置  37-38
    3.1.3 主要仪器设备  38
  3.2 方法  38-40
    3.2.1 诱导后菌体的处理  38
    3.2.2 目的蛋白的柱纯化  38-39
    3.2.3 目的蛋白的 Western-blotting 鉴定  39
    3.2.4 透析袋的前处理  39
    3.2.5 透析与浓缩  39
    3.2.6 融合蛋白的定量  39-40
  3.3 结果与分析  40-42
    3.3.1 目的蛋白的柱纯化结果  40
    3.3.2 目的蛋白的 Western-blotting 鉴定  40-41
    3.3.3 蛋白定量结果  41-42
  3.4 讨论  42-43
第四章 融合蛋白在 IFN-γ释放试验中的应用  43-50
  4.1 材料与方法  43-44
    4.1.1 主要试剂耗材  43
    4.1.2 主要仪器设备  43
    4.1.3 试验所用溶液及配置  43-44
  4.2 方法  44-46
    4.2.1 试验牛的选取  44
    4.2.2 待检牛全血的采集及培养  44
    4.2.3 牛 IFN-γ的 ELISA 检测  44
    4.2.4 检测结果的判定标准  44-45
    4.2.5 刺激原最适剂量的确定  45
    4.2.6 特异性敏感性试验  45
    4.2.7 阳性牛的验证  45-46
  4.3 结果与分析  46-49
    4.3.1 刺激原最适剂量的确定  46-47
    4.3.2 特异性敏感性试验结果  47-48
    4.3.3 阳性牛的验证结果  48-49
  4.4 讨论  49-50
第五章 全文结论  50-51
参考文献  51-56
致谢  56-57
作者简历  57

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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