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柱状黄杆菌嗜热菌蛋白酶基因的鉴定

作　者: 李军华
导　师: 文春根
学　校: 南昌大学
专　业: 动物学
关键词: 柱状黄杆菌 嗜热菌蛋白酶 外膜蛋白 毒力因子
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 55次
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内容摘要


柱形病是一种全球性的危害极广的细菌性病，主要危害鱼类的鳃组织，也可引起体表溃烂，其病原为黄杆菌科的柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)。由该病原菌引起的细菌性烂鳃病在我国流行较广且危害严重，是草鱼(Ctenopharyngdon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等重要养殖鱼类的主要疾病。对该病原菌的研究表明其感染力与其对鳃组织的粘附力有关。蛋白酶、粘附因子和硫酸软骨素AC裂解酶被认为是F.columnare的毒力因子。细菌的外膜蛋白是细菌与细胞外环境相互作用的界面，是革兰氏阴性菌较为重要的免疫原。本研究以我国分离的引起柱形病的病原为对象，开展了F.columnare的毒力因子基因的鉴定方面的研究。构建F.columnare的三个平行表达文库，制备抗其外膜蛋白(OMPs)的兔抗。对文库进行影印后进行菌落原位杂交，挑取阳性克隆测序分析，采用基因组步移的方法进行全长克隆。从F.columnare的表达文库中筛选出嗜热菌蛋白酶(Thermolysin,TLN)基因，其开放阅读框包含2709nt，编码902aa。氨基酸序列比对发现TLN含有两个锌金属蛋白酶保守基序HExxH和GxxNExxSD。将TLN催化域和α螺旋域克隆至原核表达载体pET-32a(+)，转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白TLN-C在分子量约58kD处有明显表达带，主要以不可溶的包涵体形式存在。变性条件下利用His·Bind树脂纯化融合蛋白，用其免疫新西兰大白兔，获得兔抗重组TLN-C多克隆抗体。用抗六个组氨酸的单抗或是兔抗重组蛋白多抗进行免疫印迹，这些抗体能有效地与重组蛋白(58 kD)结合，在F.columnare全菌蛋白和胞外蛋白约42kD处以及全菌蛋白和外膜蛋白约35kD处出现了阳性条带。

全文目录


中文摘要  3-4
英文摘要  4-6
缩略语表  6-7
目录  7-9
第一章 柱状黄杆菌与微生物金属蛋白酶  9-26
  1. 柱形病与柱状黄杆菌  9-17
    1.1 柱形病的发现和病原的分离  9
    1.2 病原体的形态特征与培养特性  9-10
    1.3 柱状黄杆菌及其血清型  10-11
    1.4 宿主范围和病原性  11-13
    1.5 感染及流行  13-14
    1.6 症状及病理  14-15
    1.7 柱形病的诊断及预防  15-17
  2. 微生物金属蛋白酶与病原性  17-26
    2.1 金属蛋白酶家族  17-19
    2.2 金属蛋白酶的合成、成熟和分泌  19-20
    2.3 肠源病原性影响  20-21
    2.4 血管渗透性的加强  21-22
    2.5 组织损伤  22-23
    2.6 细胞毒性  23
    2.7 细菌侵染的促进作用  23-25
    2.8 本研究的目的  25-26
第二章 柱状黄杆菌嗜热菌蛋白酶基因的免疫筛选、原核表达和免疫印迹  26-41
  1. 前言  26
  2. 材料和方法  26-33
    2.1 主要仪器设备  26-27
    2.2 主要试剂  27-28
    2.3 柱状黄杆菌G_4表达文库的构建  28
    2.4 文库筛选  28
    2.5 TLN全长的获得  28-29
    2.6 重组嗜热菌蛋白酶的原核表达及免疫印迹  29-33
      2.6.1 表达载体的构建与鉴定  29-30
      2.6.2 重组TLN-C基因的诱导表达  30
      2.6.3 表达产物的鉴定  30
      2.6.4 变性条件下亲和层析纯化包涵体形式的目的蛋白  30-31
      2.6.5 外膜蛋白和胞外蛋白的提取  31-32
      2.6.6 兔抗重组蛋白多克隆抗体的制备  32
      2.6.7 Western免疫印迹  32-33
  3. 结果  33-39
    3.1 柱状黄杆菌TLN的序列全长  33-34
    3.2 柱状黄杆菌TLN-C的原核表达  34-37
    3.3 重组TLN-C的免疫印迹分析  37-39
  4. 讨论  39-41
致谢  41-42
参考文献  42-52
附录  52-54

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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