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黄河口地区致病性猪链球菌分离鉴定与主要毒力因子的PCR检测

作　者: 张振苹
导　师: 崔言顺
学　校: 山东农业大学
专　业: 兽医
关键词: 猪链球菌生化试验药敏试验毒力因子双重PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是危害现代养猪业的一种重要人兽共患病病原,该菌血清型多、抗原结构复杂,在临床上可呈现不同的特征,如败血症、脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎等,还常常与其他疾病合并感染,发病率和死亡率较高。由于目前对猪链球菌病的发生规律、病原特性以及防治措施还不是十分清楚,单纯靠药物又不能有效地控制该病的发生和蔓延。2005—2009年,黄河口地区的规模化养猪场所饲养的猪有不同程度的猪链球菌病发生。该试验从病原学着手研究,在对黄河口地区分离的猪链球菌菌株进行培养、鉴定基础上,建立PCR方法对其进行毒力基因检测,以便为该病的免疫防治提供理论依据。本课题分为两个部分进行研究。1黄河口地区致病性猪链球菌的分离鉴定及耐药性状况调查收集2005年—2009年黄河口地区规模化养猪场疑似猪链球菌患病猪,根据临床诊断、病理学观察,结合病原的分离培养与鉴定等,确诊为猪链球菌病。通过革兰氏染色镜检、生化试验、药敏试验,对临床分离的猪源链球菌进行流行病学的初步研究。从该地区的发病猪分离到的15株猪源链球菌,其形态、染色、培养特征及理化特性符合猪链球菌的特点,药敏试验结果显示,黄河口地区猪链球菌仅对氨苄西林、阿米卡星、头孢噻肟、头孢唑啉敏感,而对其他常规药物已产生了不同程度的耐药性。2猪链球菌两种主要毒力因子的双重PCR检测根据猪链球菌两种主要毒力因子基因Sly和MRP的基因序列,设计和合成了2对特异性引物,通过体系和条件优化,建立双重PCR检测方法,对15株背景明确的猪链球菌保存菌株进行检测。结果显示,Sly检出率为4/15,MRP检出率为2/15,阳性、阴性对照均成立。分析结果表明该双重PCR检测方法,特异性和敏感性较好,可用于快速诊断以及猪链球菌相关毒力因子的分子流行病学调查。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
符号说明  12-13
引言  13-29
  1 猪链球菌病研究进展  13-18
    1.1 病原学研究  14-15
      1.1.1 分类地位  14
      1.1.2 形态染色  14-15
      1.1.3 培养特性  15
      1.1.4 生化反应  15
    1.2 流行病学研究现状  15-17
      1.2.1 传染源  16
      1.2.2 易感动物  16
      1.2.3 传播途径  16-17
      1.2.4 流行特点  17
    1.3 分类学特性  17-18
      1.3.1 根据溶血情况分类  17
      1.3.2 根据群特异性抗原（C 抗原）分类  17-18
      1.3.3 根据菌体荚膜抗原特性分类  18
  2 猪链球菌毒力因子的研究  18-24
    2.1 荚膜多糖  19
    2.2 溶菌酶释放相关蛋白(MRP)和细胞外蛋白因子(EF)  19-21
    2.3 猪链球菌溶血素(Sly)  21-22
    2.4 黏附素(adhesion)  22
    2.5 谷氨酸脱氢酶(GDH)  22-23
    2.6 纤连蛋白结合蛋白（FBPS）  23
    2.7 其它毒力因子  23-24
  3 聚合酶链式反应(PCR)在猪链球菌研究中的应用  24-29
    3.1 随机引物 PCR（AP-PCR）  24-26
    3.2 多重 PCR 技术  26-27
      3.2.1 利用荚膜多糖基因进行分型  26
      3.2.2 利用谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)和荚膜多糖基因进行分型  26-27
      3.2.3 利用 EF 基因和荚膜多糖基因进行基因分型  27
    3.3 PCR 产物的 RFLP  27-28
    3.4 重复片段 PCR(REP-PCR)  28-29
试验一黄河口地区致病性猪链球菌的分离鉴定及耐药性状况调查  29-39
  1 材料  29-31
    1.1 疑似猪链球菌病例  29
    1.2 菌株来源  29
    1.3 主要仪器  29-30
    1.4 主要试剂  30
    1.5 试验用培养基的配制  30-31
      1.5.1 Todd-Hewitt 肉汤  30
      1.5.2 普通琼脂绵羊血平板  30-31
  2 方法  31-32
    2.1 患病猪的临床观察和病理学观察  31
    2.2 病原菌的分离与鉴定  31-32
      2.2.1 直接图片镜检  31
      2.2.2 形态及培养特性观察  31
      2.2.3 病原菌的培养  31
      2.2.4 生化及生长试验  31
      2.2.5 溶血试验  31-32
    2.3 药敏试验  32
    2.4 动物致病性实验  32
  3 结果  32-36
    3.1 患病猪的临床表现和病理变化  32-34
      3.1.1 患病猪的临床表现  32-33
      3.1.2 病理变化  33-34
    3.2 病原特征  34
      3.2.1 直接涂片镜检  34
      3.2.2 细菌的分离培养  34
    3.3 病原的鉴定  34-35
      3.3.1 分离菌株的生化试验  34-35
      3.3.2 溶血性试验  35
    3.4 药敏试验  35-36
    3.5 动物致病性试验  36
  4 讨论  36-39
试验二猪链球菌两种主要毒力基因的双重 PCR 检测  39-45
  1 材料  39-40
    1.1 菌株来源  39
    1.2 主要试剂  39
    1.3 主要仪器  39-40
  2 方法  40-41
    2.1 病原菌的培养  40
    2.2 PCR 模板的制备  40
    2.3 双重 PCR 方法的建立和优化  40-41
    2.4 敏感性实验  41
    2.5 特异性实验  41
  3 结果  41-43
    3.1 检测猪链球菌毒力因子基因的 PCR 方法的建立和优化  41-42
    3.2 双重 PCR 检测  42-43
    3.3 毒力因子基因双重 PCR 检测的特异性验证  43
    3.4 敏感性实验  43
  4 讨论  43-45
结论  45-46
参考文献  46-56
致谢  56

黄河口地区致病性猪链球菌分离鉴定与主要毒力因子的PCR检测

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