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适于四膜虫的嗜水气单胞菌外膜蛋白表达载体的构建及虫菌共培养的体外试验

作　者: 张晓露
导　师: 刘永杰
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 嗜水气单胞菌嗜热四膜虫外膜蛋白密码子优化表达载体虫菌共培养用
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是人和多种动物的病原菌,其外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)具有良好的免疫原性。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种营自生的非致病性纤毛虫,许多研究表明其可作为一个理想的异种表达载体。按照真核细胞四膜虫的基因密码子偏好,优化外膜蛋白A(OmpA)基因密码子,并化学合成一段抗原性较强的基因片断,将其克隆至pUC18-T载体,经测序确定合成正确。设计一对引物在两端分别加上EcoRⅠ、XhoI酶切位点,扩增ompA基因,定向克隆至表达质粒pET32a (+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明插入片段长度为219 bp,与合成的序列相比,同源性为99%。将重组原核表达质粒pET32a-ompA转化至大肠杆菌BL21,经诱导可表达分子量约30 KD的重组蛋白,用兔抗J-1株总外膜蛋白的血清进行Western blot,在30 KD处有明显反应条带,说明所表达的优化OmpA保持原有外膜蛋白的反应原性。根据neo基因的序列和化学合成的ompA基因序列设计两对引物,调整引物中起始密码子ATG和终止密码子TGA附近的结构,分别获取neo基因和ompA部分基因片断,再通过重叠延伸的方法,将两个基因通过一疏水性柔性多肽接头(Gly4Ser)3碱基序列进行前后拼接,构建新的neo-linker-ompA融合基因。利用嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT基因作为启动子,构建了一个适于嗜热四膜虫的基因打靶载体。该载体利用MTT基因的5’侧翼区作为同源臂,中间嵌入neo-linker-ompA融合基因编码区,从而形成了一个表达盒。序列分析表明neo、ompA及接头拼接组合的顺序、方向及序列完全正确。质粒的正确构建为下一步在四膜虫中表达奠定基础,该载体既满足在四膜虫体内表达外源蛋白的需要,又具有靶向性,因此具有很强的操作性。在分别绘制嗜水气单胞菌J-1株和嗜热四膜虫BF-1株生长曲线的基础上,选择合适的感染比,探讨二者之间的相互作用关系。根据生长曲线,嗜水气单胞菌在4h后进入对数生长期,12 h左右进入稳定期,16-17 h达到最高；嗜热四膜虫的生长曲线表明,其适宜接种的初始密度为5×103细胞／mL,对数期10-44 h,稳定期44-50 h；将对数生长期和稳定期的细菌和四膜虫按照10：1,50：1,100：1的感染比混合,发现处于对数生长期的细菌全部被虫体缓慢消化,稳定期的嗜水气单胞菌以100：1感染比感染虫体时,可在虫体内增殖,出现S型增殖曲线。透射电镜显示嗜热四膜虫BF1株可吞噬嗜水气单胞菌J-1株,并一定条件下在虫体内定殖；扫描电镜下可见嗜水气单胞菌J-1株作用于虫体后,虫体胀大,沟回变浅,纤毛脱落。本试验为进一步探讨以四膜虫作为模型宿主,来研究嗜水气单胞菌的毒力奠定了基础。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-34
  第一章细菌外膜蛋白的研究进展  10-18
    1 细菌外膜蛋白的结构及功能  10-13
    2 Omp型与遗传的相关性  13
    3 Omp的致病作用  13-14
    4 Omp的免疫原性  14-15
    5 外膜蛋白应用前景展望  15-16
    参考文献  16-18
  第二章四膜虫——个极具潜力的表达体系和毒力宿主评估体系  18-34
    1 四膜虫的形态和分子结构  18-19
    2 四膜虫的遗传学特性  19-21
    3 四膜虫带给分子生物学的几大重要发现  21-23
    4 嗜热四膜虫基因组特点  23-25
    5 嗜热四膜虫作为表达体系的应用  25-27
    6 嗜热四膜虫作为毒力评估体系体系的潜力  27-28
    7 展望  28-29
    参考文献  29-34
下篇试验研究  34-86
  第三章嗜水气单胞菌J-1株ompA基因的密码子优化及蛋白原核表达  34-52
    1 材料与方法  35-44
    2 结果  44-46
    3 讨论  46-49
    参考文献  49-50
    ABSTRACT  50-52
  第四章适于嗜热四膜虫的ompA基因表达载体的构建  52-70
    1 材料和方法  53-59
    2 结果  59-64
    3 讨论  64-66
    参考文献  66-67
    ABSTRACT  67-70
  第五章嗜热四膜虫BF-1与嗜水气单胞菌J-1株共培养的体外试验研究  70-86
    1 材料  71
    2 方法  71-74
    3 结果  74-82
    4 讨论  82-84
    参考文献  84-85
    ABSTRACT  85-86
全文总结  86-88
致谢  88

适于四膜虫的嗜水气单胞菌外膜蛋白表达载体的构建及虫菌共培养的体外试验

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