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耐药嗜水气单胞菌的外膜结构和免疫原性变化的初步研究

作　者: 王美珍
导　师: 陈昌福
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 嗜水气单胞菌外膜蛋白脂多糖四环素类氟喹诺酮类耐药性
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究从自然条件下发病的濒死鱼体内分离筛选到6株对四环素类和氟喹诺酮类药物敏感的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),采用次抑菌浓度传代培养方法,人工诱导分别得到耐盐酸四环素、耐盐酸多西环素、耐诺氟沙星和耐左氧氟沙星的A. hydrophila菌株,分析敏感和耐药A. hydrophila外膜中主要保护性抗原脂多糖和外膜蛋白的SDS-PAGE电泳条带差异,初步探讨了A. hydrophila耐四环素类和氟喹诺酮类药物的多重耐药机制。制备敏感菌和人工诱导获得的耐药突变A. hydrophila的外膜蛋白、脂多糖和福尔马林灭活全菌疫苗,分别腹腔注射免疫接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus Rafinsque),探讨敏感菌和耐药菌苗的免疫效果差异,初步阐明了A. hydrophila耐药性变化和抗原性变化的关系,为耐药菌的成分疫苗及防治药物研究奠定理论基础,为耐药菌的防治提供新的思路。研究结果如下：1.获得6株致病性的A. hydrophila。其编号分别为Ah638、Ah640、Ah563、Ah541、Ah15和Ah28。参照依日本化学疗法学会制定的标准法测定试验药物对菌株的最小抑菌浓度(MIC),并查找MIC解释标准,结果表明除了Ah563、Ah638、Ah28和Ah15对盐酸四环素为中介菌外,6株A. hydrophila菌株对盐酸多西环素、诺氟沙星和左氧氟沙星均敏感,Ah541和Ah640对盐酸四环素也敏感,同时氟喹诺酮类药物的抑菌效果比四环素类药物强,尤其是左氧氟沙星的抑菌能力特别强。2.在28℃条件下培养72 h为1代,分别在含有盐酸多西环素、盐酸四环素、诺氟沙星和左氧氟沙星的药物培养基中连续传代9次后,四环素类对3个菌株的MIC上升倍数为8～32倍,氟喹诺酮类药物组MIC上升倍数为125～7997倍,且耐药获得后保持稳定。同时A. hydrophila对四环素类和氟喹诺酮类药物存在交叉耐药。耐药菌4℃保存10 d和20 d耐药性保持稳定,30 d耐药性均有不同程度的下降。3.通过比较敏感菌与耐药菌外膜蛋白和脂多糖的SDS-PAGE电泳图谱,发现所有耐药A. hydrophila的外膜蛋白片段均发生改变,不同菌株改变情况略微不同。和敏感菌相比,耐药菌有的外膜蛋白条带(42.6 kD)表达上升,有的外膜蛋白条带表达减少(36.6 kD、27.7 kD和22.2 kD)。研究发现耐药A. hydrophila的脂多糖电泳图谱均显示快速迁移条带表达密度降低,耐药性上升倍数更大的左氧氟沙星耐药菌则显示快速迁移条带迁移表达密度降低更多,蛋白酶K消化组显示条带密度更低,高水平耐药的诺氟沙星耐药菌(MIC200μg/mL)的脂多糖快速迁移条带迁移的更远。4.斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus Rafinsque)经腹腔注射免疫接种诺氟沙星敏感菌和人工诱导耐药菌的3种疫苗后,均能产生较强的免疫应答,所有受免鱼血清凝集抗体效价和交叉凝集抗体效价、溶菌酶活性、血液吞噬细胞的吞噬活性均显著高于无菌生理盐水对照组,同时耐药菌的3种疫苗的免疫指标也略高于敏感菌。活菌攻毒试验表明,各组试验鱼的相对免疫保护率(RPS)在33.3%～83.3%之间,RPS由高到低的排列顺序是OMP>LPS>FAH免疫组。在敏感菌攻毒组内,耐药菌疫苗的免疫保护率略高于敏感菌疫苗组(70%>60%；40%>30%)；在耐药菌攻毒组内,耐药菌疫苗的免疫保护率显著高于敏感菌疫苗组(83.3%>66.7%：50.0%>33.3%)。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章文献综述  11-27
  1 革兰氏阴性菌外膜通透性和外排泵系统的耐药机制  11-23
    1.1 革兰氏阴性菌的外膜(Outer membrane,OM)  11-12
    1.2 外膜通透性降低的耐药机制  12-19
      1.2.1 LPS和耐药性  12-15
      1.2.2 微孔蛋白(Porins)和耐药性  15-19
    1.3 主动外排泵系统与耐药性  19-23
      1.3.1 细菌外排泵系统的类型  19-20
      1.3.2 外排泵系统的耐药机制  20-23
  2 嗜水气单胞菌的LPS和OMP的免疫性  23-24
    2.1 OMP的免疫特性  23
    2.2 LPS的免疫特性  23-24
  3 嗜水气单胞菌耐药概况  24-26
  4 本研究的目的和意义  26-27
第二章四环素类和氟喹诺酮类敏感嗜水气单胞菌的分离与鉴定  27-34
  1 材料与方法  27-30
    1.1 病鱼来源及症状  27-28
    1.2 培养基和主要试剂  28
      1.2.1 培养基  28
      1.2.2 主要试剂和药品  28
    1.3 病原菌分离和菌种保存  28-29
    1.4 病原菌种类的鉴定  29
    1.5 菌株的攻毒感染试验  29
    1.6 菌株最小抑菌浓度(MIC)的测定  29-30
  2 结果和分析  30-33
    2.1 病原菌的生理生化特征  30
    2.2 菌株的致病力测定  30
    2.3 供试菌株对四环素类和氟喹诺酮类的敏感性  30-33
  3 讨论  33-34
第三章嗜水气单胞菌对四环素类和氟喹诺酮类的耐药性研究  34-40
  1 材料与方法  34-35
    1.1 供试药物  34
    1.2 供试菌株  34
    1.3 次抑菌浓度药物诱导产生耐药突变菌  34-35
    1.4 耐药突变菌对氟喹诺酮类和四环素类的交叉耐药  35
    1.5 突变菌耐药性的遗传稳定性  35
    1.6 耐药菌的保存条件研究  35
  2 结果与分析  35-38
    2.1 供试菌株对四环素类和氟喹诺酮类的耐药性获得速率  35-36
    2.2 耐药突变菌对氟喹诺酮类和四环素类的交叉耐药  36-37
    2.3 突变菌耐药性的遗传稳定性  37-38
    2.4 耐药菌的保存条件研究  38
  3 讨论  38-40
第四章耐四环素类和氟喹诺酮类的嗜水气单胞菌的外膜变化  40-50
  1 材料与方法  40-42
    1.1 供试菌株  40
    1.2 供试试剂  40-41
    1.3 OMP的提取和含量测定  41
    1.4 LPS的提取和含量测定  41-42
    1.5 OMP的SDS-PAGE电泳和染色  42
    1.6 LPS的SDS-PAGE电泳和染色  42
  2 结果和分析  42-46
    2.1 供试菌株MIC值  42-43
    2.2 四环素类敏感和耐药嗜水气单胞菌OMP的SDS-PAGE电泳图谱  43-44
    2.3 氟喹诺酮类敏感和耐药嗜水气单胞菌OMP的SDS-PAGE电泳图谱  44-45
    2.4 四环素类敏感和耐药嗜水气单胞菌LPS的SDS-PAGE电泳图谱  45
    2.5 氟喹诺酮类敏感和耐药嗜水气单胞菌LPS的SDS-PAGE电泳图谱  45-46
  3 讨论  46-50
第五章诺氟沙星敏感和耐药嗜水气单胞菌的免疫原性差异初步研究  50-59
  1 材料与方法  50-54
    1.1 试验鱼  50
    1.2 供试菌株  50-51
    1.3 疫苗的制备  51-52
    1.4 吞噬抗原的制备  52
    1.5 免疫与采血  52
    1.6 凝集抗体效价的测定  52-53
    1.7 溶菌酶活性的测定  53
    1.8 白细胞吞噬活性的测定  53
    1.9 攻毒菌液的准备  53
    1.10 攻毒  53
    1.11 数据处理  53-54
  2 结果与分析  54-57
    2.1 保护性抗原对受免鱼的凝集抗体效价影响  54-55
    2.2 保护性抗原对受免鱼的血清溶菌酶活性影响  55
    2.3 保护性抗原对受免鱼的血液白细胞吞噬活性影响  55-56
    2.4 保护性抗原的免疫保护性  56-57
  3 讨论  57-59
参考文献  59-69
附录1 实验补充图表  69-72
附录2 培养基和试剂的配制  72-74
附录3 在读期间发表的论文与参加的会议  74-75
致谢  75

耐药嗜水气单胞菌的外膜结构和免疫原性变化的初步研究

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