学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48可变区基因克隆及双链抗体的构建、表达与初步鉴定

作　者: 朱毅
导　师: 冯振卿
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理学
关键词: 日本血吸虫抗抗独特型抗体可变区基因克隆序列分析双链抗体载体构建蛋白表达 Dot-ELISA
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 63次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

管晓虹等(1991)建立了一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体(anti-id)，命名为NP30，经鉴定系肠相关抗原(GAA)的内影像anti-id，与可溶性虫卵抗原(SEA)及膜相关抗原(MAA)有部分交叉反应。NP30既可替代日本血吸虫虫源性抗原用于血清学诊断，又具有较好的抗感染免疫和抗病免疫作用。为分离、纯化NP30模拟的抗原分子，应用NP30免疫BALB／c小鼠，建立了1株抗NP30的抗抗独特型抗体(anti-anti-id)，定名为NP48。NP48的Ig同型为IgG2b，与可溶性成虫抗原(SWAP)和SEA的ELISA反应均为阳性。为了拓展NP48—这株本课题组有自主知识产权的抗体的应用范围，如将来构建用于诊治血吸虫病的双功能抗体，本课题在参照国内外相关研究的基础上，设计并完成了以下研究内容： 1．设计通用引物，扩增单克隆抗体NP48的可变区基因，经亚克隆、测序鉴定其序列，与多个数据库比对，进行序列分析，排除假基因。 2．设计引物，扩增NP48双链抗体基因，经亚克隆、测序鉴定其序列。构建NP48双链抗体基因的原核分泌型表达系统，分离可溶性表达产物与包涵体，鉴定其中目的蛋白的表达。对包涵体进行变性、纯化与复性处理，用Dot-ELISA初步鉴定。研究方法 1．用ELISA法鉴定NP48杂交瘤细胞活性。参照文献设计并合成多对小鼠k链与重链可变区通用引物。用Trizol一步法提取杂交瘤一一一一一一一一一一一一一一一一科大学硕士学位论文细胞总RNA，Rl’- PCR扩增vL、VH基因，经T-A连接亚克隆至pMD18一T载体，测序。PCR产物的核普酸序列与其推导的氨基酸序列与Kabat数据库、GenBank数据库比对，并进行综合分析。 2.限制性酶切图谱分析VL，V。(轻链可变区假基因的部分序列)以及VH基因，设计引物，采用SOE法，PCR扩增双链抗体基因VH一linker-VL(DR)与VH一linker- Vp(Dp)。经T-A连接亚克隆至pMD18一T载体，测序。采用质粒抽提、纯化、酶切、连接、感受态细胞制备和转化等技术，构建并鉴定原核表达载体.药物诱导方式诱导D润p蛋白的表达，并用SDS一PAGE与认触stem blot初步鉴定蛋白表达结果.对DR表达产物进行分离，用SDS一队GE与Westem blot检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量。用SM尿素对氏包涵体进行变性，HITrap亲和柱纯化变性液，纯化的变性液行透析复性.采用Dot一ELISA法，检测纯化蛋白与NP3O、SEA、S场人P的结合活性。研究结果 1.扩增出活性较好的Np48杂交瘤细胞的vL、VH基因，序列分析表明，VL基因全长336bP，属鼠免疫球蛋白、链第n亚类，由种系基因he24与J‘重排而来，编码112个氛基酸，第23位和93位为骨架区的2个半脱氛酸，是链内二硫健形成部位。该VL基因序列已被GenBank收录(aceession No.AY3ogo 10).VH基因全长354bP，属鼠免疫球蛋白重链第n亚类，由种系J558.47、Dsp2.2和JH4基因重排而来，编码118个氛基酸，第22位和%位为骨架区的2个半腕氛酸，是链内二硫键形成部位。该vH基因序列已被GenBank收录(accessionNo.AY3 1 2433)。轻链可变区的另外两条特异性PCR产物(vLLZ、VLLI)均为来自亲本骨髓瘤细胞的无功能基因，其序列与国内外报道相一致。 2.测序证实了双链杭体基因vH一hnker-vL(DR)与vH一linker-vp南京医科大学硕士学位论文(Dp)。原核分泌型表达系统pBAD/g川一DR、pBAD/gln一D。构建成功，并分别在大肠杆菌Top .0中被诱导，二者均获得高表达量的c一末端带有c一myc10肤及多聚组氨酸(His)6标签序列的重组融合表达蛋白(30%)。超声裂菌法分离的结果显示pBAD/gm一DR的融合表达蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。用镍柱纯化包涵体的变性液，复性后用Dot ELISA法鉴定结果表明，DR基因表达的纯化蛋白可与NP30特异性结合。结论 1.经序列分析证明，体外扩增所得的vL、vH基因为日本血吸虫单克隆anti一anti一idNP48的可变区基因。 2.所构建的NP48的单特异性双链杭体基因的表达产物具有亲本单抗的特异性和亲和力。本部分研究再次证实了获得的可变区基因为NP48的功能性可变区基因。本部分研究对用于血吸虫病诊治的双功能抗体的构建，既准备了候选分子又在方法上具有重要指导意义。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
前言  12-14
正文  14-59
  研究一日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析  14-33
  研究二日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48双链抗体的构建、表达与初步鉴定  33-59
小结  59-60
参考文献  60-65
附页  65-68
致谢  68-69
综述: scFv多聚体的研究进展  69-83

日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48可变区基因克隆及双链抗体的构建、表达与初步鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文