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通过棉花叶片水孔蛋白基因的研究提高棉花的抗旱性

作　者: 祝毅
导　师: 张煜星；祝建波
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水孔蛋白 质膜水孔蛋白基因 RNA干扰
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


水孔蛋白是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子的水通道蛋白,它大量存在于动物、植物及微生物等多种生物中。它所介导的自由水快速被动地跨生物膜转运是水进出细胞的主要途径。在植物发育过程中编码不同水孔蛋白的基因的表达与不同的生理过程相关,包括气孔的关闭、器官运动、细胞伸长以及细胞分裂,而且它还在植物种子萌发、韧皮部的装卸及逆境应答等过程中调节水分跨膜快速流动,因此植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道,介导胞内或胞间的水分跨膜运输,调节植物体内的水分快速平衡,对于提高植物抗盐及抗旱性可能发挥着重要作用。根据目前国内外的研究状况,在棉花中只发现了两类水孔蛋白,分别是质膜内在蛋白和液泡膜内在蛋白,其中质膜内在蛋白只是在棉花的根、茎和胚珠中发现有表达,而在叶片中的表达量很少。而在本研究中,采用RT-PCR的方法,根据GenBank上公布的棉花水孔蛋白基因序列设计引物,从棉花叶片中克隆得到了四个棉花质膜水孔蛋白基因,分别为GhPIP1;1、GhPIP1;2、GhPIP2;1和GhPIP2;2,测序结果与公布序列的相似性都在99%以上,氨基酸序列更是在99%以上。然后构建了植物表达载体pBI121-GhPIP,通过农杆菌介导的方式转化模式植物烟草,获得转基因烟草再生植株,经初步RT-PCR分析证明转基因植株能够正常转录。本研究还分别选取四个基因的300bp做干扰片段用以构建RNA干扰载体,先构建好中间载体,然后构建到表达载体pCAM2300上,用以对棉花胚性愈伤组织的转化。观察转化的棉花愈伤组织的生长状况,然后测其愈伤组织的干重与鲜重比,对比对照组发现,对水分的调控能力有所增强,这说明达到了干扰的目的,沉默了该基因,为以后进一步研究该类基因打下基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
英文缩写表  9-10
前言  10-11
第一章 文献综述  11-18
  1.1 植物水孔蛋白的研究进展  11-17
    1.1.1 水孔蛋白的发现  11-12
    1.1.2 植物水孔蛋白的结构特征及分类  12
    1.1.3 植物水孔蛋白的生化特性  12-13
    1.1.4 植物水孔蛋白的主要功能  13-14
    1.1.5 水孔蛋白的调节  14-17
  1.2 关于RNA干扰  17-18
第二章 实验材料和涉及的方法技术  18-21
  2.1 实验材料  18
    2.1.1 仪器设备  18
    2.1.2 植物材料  18
    2.1.3 菌株和质粒  18
    2.1.4 分子生物学试剂  18
  2.2 涉及的分子生物学基本方法技术  18-21
    2.2.1 碱裂解法小量提取质粒DNA  18-19
    2.2.2 植物总DNA的提取  19
    2.2.3 植物总RNA提取方法  19
    2.2.4 大肠杆菌和农杆菌感受态细胞的制备  19-20
    2.2.5 DNA的回收  20
    2.2.6 热激法转化(大肠杆菌)  20
    2.2.7 冻融法转化(农杆菌)  20
    2.2.8 质粒DNA的酶切  20-21
第三章 棉花水孔蛋白基因的克隆、植物表达载体的构建及其对烟草的转化  21-28
  3.1 材料与方法  21-24
    3.1.1 材料  21
    3.1.2 方法  21-24
  3.2 结果与分析  24-28
    3.2.1 棉花叶片水孔蛋白基因的克隆  24-26
    3.2.2 植物表达载体pBI121-GhPIP的构建及其鉴定  26
    3.2.3 含pBI121-GhPIP重组质粒的农杆菌GV3101菌株的鉴定  26
    3.2.4 转基因烟草的PCR和RT-PCR检测  26-28
第四章 RNA干扰载体的构建及其对棉花愈伤组织的转化  28-36
  4.1 材料与方法  28-32
    4.1.1 材料  28
    4.1.2 方法  28-32
  4.2 结果与分析  32-36
    4.2.1 干扰片段的PCR扩增和XhoⅠ/BglⅡ双酶切pGM-iGhPIP质粒电泳图  32
    4.2.2 正向片段连接到中间载体的PCR检测和酶切检测  32-33
    4.2.3 反向片段连接到中间载体的PCR检测和酶切检测  33-34
    4.2.4 pCAM2300-iGhPIP的PCR检测和酶切检测  34
    4.2.5 农杆菌转化子的PCR检测  34-35
    4.2.6 棉花愈伤组织的诱导和转化  35-36
第五章 结论与讨论  36-38
  5.1 实验结论  36
  5.2 讨论  36-38
    5.2.1 关于棉花水孔蛋白基因和水孔蛋白  36-37
    5.2.2 关于棉花愈伤组织的培养和转化  37-38
参考文献  38-42
附录一 主要技术路线  42-43
附录二 GhPIP基因序列比对  43-50
附录三 RNA干扰载体的构建示意图  50-51
附录四 常用培养基及溶液配制  51-53
致谢  53-54
作者简介  54-55
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表  55

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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