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皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino.）△6脂肪酸去饱和酶（△6FAD）基因克隆以及不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍生长、脂肪酸组成和△6FAD表达的影响

作　者: 李明珠
导　师: 麦康森
学　校: 中国海洋大学
专　业: 动物学
关键词: 皱纹盘鲍 △6脂肪酸去饱和酶(△6FAD) HUFA 基因克隆荧光实时定量PCR(RT-PCR) 脂肪酸植物油鱼油
分类号: S963
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本论文以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)为对象,研究了不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍生长和体内脂肪酸组成的影响。研究结果提示皱纹盘鲍具有高不饱和脂肪酸(High Unsaturated Fatty Acid,HUFA)的合成能力。在此基础上研究了植物油和鱼油对皱纹盘鲍稚鲍HUFA合成能力的影响,并克隆了HUFA合成关键酶Δ6FADcDNA全长、研究了不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺和肌肉Δ6FAD mRNA表达的影响。结果如下：1、饲料中不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍存活、生长以及肝胰腺和肌肉中脂肪酸组成的影响。采用5种不同油脂：橄榄油(Olive Oil,OO)、葡萄籽油(Grape Seed Oil,GO)、亚麻籽油(Linseed Oil,LO)、EPA油(EPA Oil,EO)和ARA油(ARA Oil,AO)作为饲料脂肪源(添加量为3.5%)配置5种精制饲料,在室内循环水养殖系统中对皱纹盘鲍稚鲍(初始体重为(0.38±0.01)g,初始壳长为(15.06±0.21)mm)进行为期120天的养殖试验。试验结果表明,饲料中不同的脂肪源显著的影响了皱纹盘鲍稚鲍的生长(P<0.05)。OO对皱纹盘鲍稚鲍的生长效果最好,其次为富含HUFA的AO和EO,而投喂只富含C18：2n-6的GO和富含C18：3n-3的LO则对皱纹盘鲍稚鲍的生长具有显著抑制作用(P<0.05)。皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺和肌肉中脂肪酸的组成与饲料中脂肪酸模式呈正相关关系。OO和GO处理组稚鲍肝胰腺脂肪酸的组成显示出皱纹盘鲍具有以C18：2n-6和C18：3n-3为底物分别形成ARA和EPA的能力,但由EPA合成DHA的能力较弱。2、Δ6FAD基因的克隆以及不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺和肌肉组织Δ6FAD mRNA表达量的影响。利用同源性克隆和3’RACE、5’RACE技术克隆了皱纹盘鲍Δ6FADcDNA全长。皱纹盘鲍Δ6FADcDNA包括1525个核苷酸,其中开放阅读框包括1320个核苷酸,编码一个由439个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白包括Δ6FAD的三个显著特征：组氨酸保守区(和二价铁离子结合形成催化活性中心)、类似于细胞色素b5的血红素结合域-HPGG,以及长的疏水区形成的跨膜结构。其氨基酸序列与脊椎动物的△6FAD序列有很高的同源性(>49%)。荧光实时定量PCR法分析了饲喂不同脂肪源的皱纹盘鲍肝胰腺和肌肉组织△6FAD mRNA的表达水平。结果表明与富含C18不饱和脂肪酸的植物油(OO)相比,富含HUFA的鱼油显著抑制了皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺中△6FAD mRNA表达。与其他脂肪源相比,GO则显著提高了皱纹盘鲍稚鲍肌肉中△6FAD mRNA表达(P<0.05)。上述结果首次证明皱纹盘鲍具有利用C18：2n-6和C18：3n-3合成HUFA的能力,并且这种合成能力受到饲料中不同脂肪源的影响。植物油中的C18PUFA可以诱导△6FAD mRNA的表达,并促进HUFA的合成。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章海水养殖动物必需脂肪酸合成研究进展  12-31
  1 脂肪酸简介  12
  2 必需脂肪酸的生理功能  12-13
  3 脂肪酸的合成  13-14
  4 海水鱼类EFA的合成  14-20
    4.1 饱和脂肪酸到单不饱和脂肪酸的合成  15
    4.2 C18:2n-6和C18:3n-3的合成  15-16
    4.3 ARA和EPA的合成  16-18
    4.4 DHA的合成  18-20
  5 海洋无脊椎动物EFA的合成  20-21
  6 总结与展望  21-23
  参考文献  23-31
第二章不同脂肪源对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)稚鲍存活、生长以及肌肉和肝胰腺组织脂肪酸组成的影响  31-49
  1 引言  31-32
  2 材料和方法  32-34
    2.1 实验饲料  32
    2.2 实验动物及管理  32-33
    2.3 样品的采集和处理  33
    2.4 样品分析  33-34
      2.4.1 生长指标的测定  33
      2.4.2 饲料和组织中脂肪酸含量的测定  33-34
    2.5 统计分析  34
  3 结果  34-36
    3.1 饲料中不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍生长以及存活的影响  34-35
    3.2 饲料中不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺脂肪酸组成的影响  35-36
    3.3 饲料中不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肌肉脂肪酸组成的影响  36
  4 讨论  36-40
  5 小结  40-41
  参考文献  41-44
  附图表  44-49
第三章皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)△6FAD基因的克隆、序列分析以及不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺和肌肉△6FADmRNA表达量的影响  49-88
  1 引言  49-50
  2 材料和方法  50-65
    2.1 实验动物  50-51
    2.2 实验方法  51-65
      2.2.1 △6FAD基因的克隆  51-60
        2.2.1.1 △6FAD基因核心片段克隆  51-56
        2.2.1.2 △6FAD基因3’RACE  56-58
        2.2.1.3 △6FAD基因5’RACE  58-60
      2.2.2 △6FAD基因全长序列分析和系统进化分析  60
      2.2.3 不同脂肪源对△6FAD mRNA相对表达量的测定  60-65
        2.2.3.1 体组织总RNA的提取(步骤同前)  61
        2.2.3.2 体组织总RNA DNase Ⅰ处理  61
        2.2.3.3 反转录反应合成cDNA一链  61-62
        2.2.3.4 荧光实时定量PCR(RT-PCR)  62-65
    2.3 统计分析  65
  3 结果  65-69
    3.1 △6FAD全长克隆结果  65-66
      3.1.1 所提取的肝胰腺组织总RNA质量检验  65
      3.1.2 △6FAD核心片段克隆结果  65
      3.1.3 △6FAD3’RACE结果  65-66
      3.1.4 △6FAD5’RACE结果  66
    3.2 △6FAD全长序列和结构分析  66-68
      3.2.1 A6FAD基因全长cDNA序列及推测编码的氨基酸序列分析  66-67
      3.2.2 A6FAD全长跨膜分析与亲疏水性分析  67
      3.2.3 A6FAD多序列比对和系统进化树分析  67-68
        3.2.3.1 与其他物种A6FAD序列比对  67-68
        3.2.3.2 系统进化树分析  68
    3.3 不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺和肌肉A6FAD mRNA表达量的影响  68-69
      3.3.1 所提取的肝胰腺和肌肉总RNA经DNase Ⅰ处理后质量检验  68
      3.3.2 目的基因(A6FAD)与看家基因(RPS9)的扩增效率验证  68-69
      3.3.3 不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺和肌肉看家基因RPS9 mRNA表达量的影响  69
      3.3.4 不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍肝胰腺和肌肉中A6FAD mRNA相对表达量的影响  69
  4 讨论  69-72
  5 结论  72-74
  参考文献  74-78
  附图表  78-88
致谢  88-89

皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino.）△6脂肪酸去饱和酶（△6FAD）基因克隆以及不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍生长、脂肪酸组成和△6FAD表达的影响

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