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大鼠胎肝干细胞的分离培养与鉴定以及免疫源性的研究

作　者: 曲丽梅
导　师: 李玉林
学　校: 吉林大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 大鼠胎肝干细胞分离培养鉴定免疫源性
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目前,关于干细胞的研究成为医学界的热点,其可观前景在于可以作为组织工程的种子细胞,构建人工器官,在临床器官移植中发挥重要作用,但是器官移植的障碍还有免疫排斥问题,至今研究很少。关于胎肝干细胞的研究,目前集中在体外分离培养、鉴定及诱导分化,但对其免疫源性的研究国内外未见报道。本研究采用机械剪碎酶消化法分离大鼠胎肝干细胞,进一步的贴壁培养来提高细胞纯度,通过细胞免疫荧光化学染色、免疫细胞化学染色、过碘酸-雪夫氏染色及白蛋白检测等方法对分离培养的大鼠胎肝干细胞进行鉴定,通过免疫细胞化学染色及流式细胞术对其免疫源性做了初步研究,结果如下:1大鼠胎肝干细胞的形态观察细胞接种24小时后,普通光镜下可见细胞贴壁,贴壁细胞形态一致,呈卵圆形,核大,胞质少;48小时观察细胞为圆形,大小几乎一致;第5-7天,细胞长成片,呈集落样,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,边缘清楚;8天细胞铺展,呈上皮样。细胞原代或传代培养至接种第12天时,细胞变大,成圆形或多角形,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢。2大鼠胎肝干细胞的鉴定通过细胞免疫荧光化学染色检测到大鼠胎肝干细胞甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18, CK18)细胞角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)呈阳性表达,成鼠肝细胞都呈阴性;免疫细胞化学染色检测到胎肝干细胞OV6阳性表达,而成鼠肝细胞阴性表达;胎肝干细胞的过碘酸-雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain, PAS染色)阳性比成鼠肝细胞弱,但也说明有糖原物质存在;利用半自动生化分析仪检测到了白蛋白的存在,这些结果可以证明所得到的细胞为胎肝干细胞。3大鼠胎肝干细胞的免疫源性检测免疫细胞化学染色检测到胎肝干细胞主要组织相容性复合体(major histocompability complex-1, MHC-1)的表达,但弱于成鼠肝细胞;通过流式细胞术比较了大鼠胎肝干细胞和成鼠肝细胞MHC-1的表达,结果前者31.26%±4.56,后者表达42.94%±3.51,P<0.05,有统计学差异。以上结果表明,用免疫荧光技术分析,分离的细胞纯度可达95%以上,所选择的高度特异的标记物都呈阳性表达,对照成鼠肝细胞阴性表达,说明分离培养的细胞为大鼠胎肝干细胞,其表达MHC-1分子低于成熟肝细胞,提示胎肝干细胞的免疫源性可能较成熟肝细胞低。

全文目录

内容提要  4-10
引言  10-15
材料与方法  15-26
  1 实验材料  15-17
    1.1 主要仪器与设备  15-16
    1.2 主要试剂  16-17
    1.3 实验动物  17
  2 实验方法  17-23
    2.1 大鼠胎肝干细胞的分离与培养  17-18
      2.1.1 大鼠胎肝干细胞的分离  17
      2.1.2 大鼠胎肝干细胞的培养  17-18
    2.2 大鼠成鼠肝细胞的分离  18
    2.3 大鼠胎肝干细胞的鉴定  18-21
      2.3.1 细胞免疫荧光化学染色  19-20
      2.3.2 免疫细胞化学染色  20
      2.3.3 过碘酸－雪夫氏染色  20-21
      2.3.4 白蛋白的检测  21
    2.4 大鼠胎肝干细胞免疫源性的检测  21-23
      2.4.1 免疫细胞化学染色  21-22
      2.4.2 流式细胞术  22-23
    2.5 数据的统计学处理  23
  3 实验结果  23-26
    3.1 大鼠胎肝干细胞的分离、培养及纯度  23-24
    3.2 大鼠胎肝干细胞的鉴定  24-25
      3.2.1 细胞免疫荧光化学染色  24
      3.2.2 免疫细胞化学染色  24
      3.2.3 过碘酸－雪夫氏染色  24
      3.2.4 白蛋白的检测  24-25
    3.3 大鼠胎肝干细胞的免疫源性的检测  25-26
      3.3.1 免疫细胞化学染色  25
      3.3.2 流式细胞术  25-26
讨论  26-30
结论  30-31
参考文献  31-35
附图  35-40
中文摘要  40-43
英文摘要  43-47
攻读学位期间发表的学术论文和获奖情况  47-48
致谢  48

大鼠胎肝干细胞的分离培养与鉴定以及免疫源性的研究

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