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产琥珀酸大肠杆菌代谢工程的研究

作　者: 吴婵媛
导　师: 赵学明
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 大肠杆菌 琥珀酸 ptsG敲除 半乳糖协同运输体系 葡萄糖脱氢酶 代谢通量分析
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 431次
引　用: 3次
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内容摘要


本文通过敲除ptsG基因和构建不同的质粒得到一系列产琥珀酸的Escherichia coli基因工程菌,研究了在大肠杆菌中磷酸转移酶系统(PTS)、半乳糖协同运输体系和磷酸戊糖途径的葡萄糖脱氢酶对大肠杆菌琥珀酸合成的影响,成功地通过敲除ptsG基因和扩增galp、glk、gdh基因改变了工程菌株琥珀酸的合成能力。最后本文建立了Escherichia coli的厌氧生化反应网络,对野生型大肠杆菌W1485和ptsG敲除菌株TUQ2和TUQ2/pQZ3的代谢通量分布作了比较分析。得到的主要结果如下:利用Red同源重组技术,构建ptsG基因缺陷株TUQ2在厌氧情况下,敲除菌株TUQ2的琥珀酸产量是原始菌株W1485的5倍,乳酸、甲酸、乙酸和乙醇这些主要副产物的产量都有不同程度的下降。ptsG基因的缺失能够提高琥珀酸的产量,但它会减慢葡萄糖的吸收速率,从而导致菌株的生长缓慢。因此我们构建了质粒pQZ3和pQZ4,分别表达了galp和glk两个基因,而当大肠杆菌用半乳糖协同运输体系时,借助半乳糖渗透酶(galp)运输糖到胞内,同时葡萄糖激酶(glk)将其磷酸化,提高了厌氧发酵时葡萄糖的吸收速率和菌体细胞生长速率,但合成琥珀酸的能力没有变化。通过NADH的再生提供更多的还原力可以使琥珀酸的转化率得到提高,即提高大肠杆菌产NADH的能力。从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中克隆出葡萄糖脱氢酶基因片段,整合到质粒pET28a(+)中并在大肠杆菌在中进行表达,由其编码生成葡萄糖脱氢酶,增强了葡萄糖脱氢酶的表达,促进了NADH的再生。建立了Escherichia coli产琥珀酸基因工程菌的生化反应网络及计量学模型。通过对构建菌株的代谢通量分析表明:PEP在代谢过程中易受到糖代谢途径的影响,也即在代谢中易于被调控。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
前言  7-8
第一章 文献综述  8-21
  1.1 琥珀酸的理化性质  8-9
  1.2 琥珀酸的应用与供需情况  9-11
    1.2.1 琥珀酸在食品行业的应用  9-10
    1.2.2 琥珀酸在医药行业的应用  10
    1.2.3 琥珀酸在化学工业的应用  10-11
    1.2.4 琥珀酸的其他应用领域  11
  1.3 琥珀酸的生产方法  11-13
    1.3.1 化学合成法  11-12
    1.3.2 微生物发酵法  12
    1.3.3 琥珀酸生产方法的比较  12-13
  1.4 琥珀酸发酵研究现状  13-20
    1.4.1 产琥珀酸厌氧螺菌研究进展  14
    1.4.2 产琥珀酸放线杆菌研究进展  14-16
    1.4.3 产琥珀酸大肠杆菌研究进展  16-17
    1.4.4 菌种优化原理  17-20
  1.5 本实验主要任务  20-21
第二章 实验材料及方法  21-35
  2.1 实验仪器及设备  21-22
  2.2 实验药品及试剂的配制  22-26
    2.2.1 实验药品和试剂  22-24
    2.2.2 实验试剂的配制  24-26
  2.3 实验方法  26-35
    2.3.1 发酵液中有机酸和葡萄糖的检测方法  26-29
    2.3.2 分子克隆试验  29-35
第三章 基因的缺失和扩增  35-59
  3.1 菌种和质粒  35-39
    3.1.1 pUC18 质粒  35-37
    3.1.2 pET28a(+)质粒  37-38
    3.1.3 pACYC184 质粒  38
    3.1.4 pTP801 质粒  38
    3.1.5 pKD46 质粒  38-39
  3.2 ptsG 基因的敲除  39-46
    3.2.1 敲除的基本原理  39-40
    3.2.2 ptsG 敲除菌株的构建  40-43
    3.2.3 实验结果与讨论  43-46
  3.3 重组质粒的构建  46-58
    3.3.1 质粒pQZ3和pQZ5的构建  46-49
    3.3.2 质粒pQZ4 的构建  49-52
    3.3.3 实验结果和讨论  52-54
    3.3.4 质粒pQZ10 的构建  54-56
    3.3.5 实验结果和讨论  56-58
  3.4 本章小结  58-59
第四章 代谢通量分析  59-68
  4.1 代谢通量分析原理  59-60
  4.2 E.coli 的生化反应网络  60-62
  4.3 E.coli 代谢模型的建立  62-64
  4.4 拟稳态方程组的求解  64
  4.5 结果与讨论  64-68
第五章 结论  68-69
参考文献  69-74
附录  74-75
发表论文  75-76
致谢  76

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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