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琥珀酸生产菌的选育

作　者: 黄新林
导　师: 林日辉
学　校: 广西民族大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 琥珀酸鉴定筛选诱变发酵性能
分类号: TQ922.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

琥珀酸是一种重要的化工原料,广泛运用于人们的日常生活中。目前,琥珀酸的生产分为化学合成法和微生物发酵法,前者消耗大量不可再生资源,同时产生严重环境污染；后者具有成本低、无污染、可再生、转化率高等特点,同时微生物发酵法生产琥珀酸的过程是固定CO2的过程,采用发酵法生产琥珀酸有助于减少CO2的排放,减弱温室效应,为人类实现低碳生活做贡献。本课题通过构建快速、简便的筛选方法,从自然界中分离、筛选出产琥珀酸优良菌株；通过进一步的诱变,筛选高产突变菌；并初步探索琥珀酸发酵的影响因素,为后续工业化发酵生产提供出发菌种及其性能的基本数据。实验具体研究如下：(1)设计新的富集方案。该阶段的研究重点是目标菌的富集。在富集培养基中添加草氨酸、二硝基苯酚等抑制剂,抑制杂菌及原虫的生长繁殖；添加富马酸促进目标菌株的生长,达到富集目标菌株的目的。(2)构建有效的检测分离方法。该时期的研究重点是发酵检测。运用新的CuSO4显色方法,定性检测发酵液中的琥珀酸,该方法灵敏度高,检测方便,即使琥珀酸浓度为0.1 g/L也能快速检测出来。通过该方法筛选到目标菌株mdrh-5,其琥珀酸转化率达到28.9%,琥珀酸与乙酸的产量的比例为2：1。(3)菌株的诱变育种。以mdrh-5为原始菌株,采用紫外线、NTG及两者的复合式诱变处理,依据微生物发酵产琥珀酸的代谢途径,设计氟乙酸平板作为筛选平板,定向筛选出8株正突变菌株,其中突变菌株mdrh-5 M4的琥珀酸产量为7.87 g/L,比原始菌株提高了43%,乙酸产量减少了66%。(4)发酵性能的初步探索。以突变菌mdrh-5 M4为研究对象,在起始葡萄糖浓度为60g/L时,调节pH至7.0,100%C02气室环境,37℃恒温培养36 h,琥珀酸产量为23.92 g/L,琥珀酸/乙酸(g/L)为7：1,糖转化率为43.6%。另外,确定琥珀酸最大抑制浓度为40 g/L。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
1 绪论  9-22
  1.1 琥珀酸的结构特性及应用  9-13
    1.1.1 琥珀酸的物化性质  9-10
    1.1.2 琥珀酸的应用  10-11
    1.1.3 琥珀酸的市场概况  11-13
  1.2 琥珀酸的生产  13-14
    1.2.1 化学合成法  13
    1.2.2 微生物发酵法  13-14
  1.3 发酵法生产琥珀酸研究现状  14-17
    1.3.1 有氧条件下的琥珀酸发酵研究  14-15
    1.3.2 厌氧条件下的琥珀酸发酵研究  15-17
  1.4 理化诱变及基因工程技术对产琥珀酸菌选育的研究  17-20
    1.4.1 理化诱变对产琥珀酸菌选育的研究  17-18
    1.4.2 基因工程技术对产琥珀酸菌选育的研究  18-20
  1.5 本课题的研究目的、意义及内容  20-22
    1.5.1 本课题的研究目的和意义  20
    1.5.2 本课题的主要研究内容  20-22
2 产琥珀酸细菌的筛选及鉴定  22-41
  2.1 前言  22-24
  2.2 材料与方法  24-28
    2.2.1 菌种  24
    2.2.2 仪器设备与实验药品  24-25
      2.2.2.1 主要仪器设备  24-25
      2.2.2.2 主要实验药品  25
    2.2.3 实验方法  25-28
      2.2.3.1 培养基配制  25-26
      2.2.3.2 灭菌方法  26
      2.2.3.3 富集、分离筛选及发酵培养方法  26-27
      2.2.3.4 发酵液检测方法  27
      2.2.3.5 菌株鉴定  27-28
  2.3 筛选方案设计  28-30
  2.4 结果与分析  30-39
    2.4.1 产琥珀酸菌株的初筛  30-31
    2.4.2 添加抑制剂对产琥珀酸菌株筛选的影响  31
    2.4.3 发酵液检测结果  31-39
      2.4.3.1 CuSO_4甲醇溶液检测结果  31-33
      2.4.3.2 HPLC定性定量分析  33-34
      2.4.3.3 生理生化及分子生物学鉴定结果  34-39
  2.5 本章小结  39-41
3 琥珀酸生产菌的诱变筛选  41-59
  3.1 前言  41-43
  3.2 材料与方法  43-44
    3.2.1 材料与仪器  43-44
      3.2.1.1 菌种  43
      3.2.1.2 实验药品  43-44
      3.2.1.3 主要实验仪器与设备  44
    3.2.2 方法  44
      3.2.2.1 培养基配置  44
      3.2.2.2 灭菌方法  44
  3.3 诱变、筛选方法  44-48
    3.3.1 诱变方案流程图  44-45
    3.3.2 诱变预处理  45
    3.3.3 紫外线照射诱变  45-46
    3.3.4 NTG诱变处理  46-47
    3.3.5 氟乙酸钠的制备及检验方法  47
    3.3.6 抗氟乙酸钠突变菌株的筛选方法  47-48
    3.3.7 检测方法  48
      3.3.7.1 CuSO4检测方法  48
      3.3.7.2 HPLC检测方法  48
  3.4 结果与讨论  48-57
    3.4.1 野生菌株mdrh-5生长曲线  48-49
    3.4.2 氟乙酸钠的制备结果  49-51
    3.4.3 紫外线最适诱变条件  51-52
    3.4.4 NTG最适诱变条件  52-53
    3.4.5 氟乙酸钠最适筛选浓度  53-54
    3.4.6 突变株与野生菌株发酵产酸性能比较  54-57
  3.5 本章小结  57-59
4 突变菌株发酵性能研究  59-69
  4.1 前言  59-60
  4.2 材料与方法  60-61
    4.2.1 材料  60
      4.2.1.1 菌种  60
      4.2.1.2 药品  60
    4.2.2 仪器与设备  60-61
    4.2.3 培养方法  61
      4.2.3.1 培养基及培养条件  61
      4.2.3.2 灭菌方法  61
      4.2.3.3 培养方法  61
    4.2.4 检测方法  61
      4.2.4.1 生物量测定方法  61
      4.2.4.2 HPLC法定性定量检测方法  61
  4.3 实验与方案  61-64
    4.3.1 方案设计图  61-62
    4.3.2 不同浓度糖对发酵的影响  62-63
    4.3.3 不同pH对发酵的影响  63
    4.3.4 添加不同琥珀酸量对发酵的影响  63
    4.3.5 不同温度对发酵的影响  63-64
  4.4 结果与讨论  64-68
    4.4.1 糖浓度对突变菌株发酵产琥珀酸的影响  64-65
    4.4.2 pH对发酵的影响  65
    4.4.3 添加不同琥珀酸量对发酵的影响  65-67
    4.4.4 温度对发酵的影响  67-68
  4.5 本章小结  68-69
5 总结与展望  69-71
  5.1 总结  69
  5.2 展望  69-71
参考文献  71-75
致谢  75-76
攻读学位期间发表的学术论文目录  76

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