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D-乳酸高产菌株的选育、发酵条件的优化及代谢通量分析

作　者: 李银镝
导　师: 赵学明
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 菊糖芽孢乳杆菌 D-乳酸 诱变 发酵优化 代谢通量分析
分类号: TQ921.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 310次
引　用: 2次
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内容摘要


乳酸是目前世界上三大有机酸之一,广泛存在于许多食物中,同时乳酸还是一些有机生物体的重要代谢产物。乳酸存在两种同分异构体,D-乳酸和L-乳酸。D-乳酸是重要的有机合成原料,是多种手性物质的前体物。广泛应用于制药、化妆品以及农药的合成。本文以菊糖芽孢乳杆菌SP-BME126为出发菌株,经过三轮紫外线诱变,以浓度为0.015%的溴甲酚紫为筛选剂,最终选育出一株D-乳酸高产菌株SP-MD1。在培养基和培养条件优化之前,SP-MD1的D-乳酸产量达到78.1g/L,比出发菌株SP-BME126的D-乳酸产量提高了7.1%,而且稳定性很好。本论文利用单因素实验研究突变株SP-MD1的摇瓶发酵条件,分别考察了发酵培养基中不同的碳源、氮源、碳酸钙量、种龄、接种量、装液量以及温度等七个因素对发酵D-乳酸的影响。并且根据单因素实验结果,采用统计学方法优化菊糖芽孢乳杆菌突变株SP-MD1生产D-乳酸的发酵过程。利用Plackett-Burman实验设计法考察培养基组分以及培养条件中的7个因素对D-乳酸生产和菌体生长的影响,并根据实验结果确定出3个重要的实验因素,然后利用响应面分析法得到D-乳酸生产的优化培养基和培养条件,即:葡萄糖95g/L、蛋白胨25g/L、种龄24h、接种量5%、碳酸钙4g/100mL、装液量112mL/500mL、温度35℃。在以上优化培养基下发酵培养菌株最终D-乳酸产量为80.5g/L,葡萄糖转化率为84.7%。本论文通过代谢通量分析的方法,分析对比了出发菌株SP-BME126和突变株SP-MD1在不同发酵时期的代谢通量分布情况。结果表明:突变株SP-MD1与出发菌株SP-BME126相比,乙酸支路通量明显下降,降幅达到34%;同时乳酸支路通量提高,乳酸得到较充分的积累,葡萄糖利用率得到较明显的提高。发现丙酮酸是菊糖芽孢乳杆菌生产D-乳酸代谢网络中的柔性节点,这为今后的工作提供了一个重要的研究方向。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章 文献综述  8-25
  1.1 D-乳酸的理化性质  8-9
  1.2 D-乳酸的应用  9-10
    1.2.1 D-乳酸在药物前体物方面的应用  9-10
    1.2.2 聚乳酸的应用  10
  1.3 D-乳酸的工业化生产方法  10-14
    1.3.1 化学合成法  10-11
    1.3.2 微生物发酵法  11-14
  1.4 D-乳酸国内外研究进展  14-19
    1.4.1 诱变方法进行菌种选育  14-15
    1.4.2 培养基及培养条件的优化  15-16
    1.4.3 碳源的选择  16-18
    1.4.4 发酵技术的研究进展  18
    1.4.5 基因工程技术对乳酸生产的影响  18-19
  1.5 D-乳酸商业生产状况  19-20
  1.6 菊糖芽孢乳杆菌简介  20
  1.7 紫外线诱变的基本原理  20-21
  1.8 应用于生物过程优化的统计学方法  21-22
    1.8.1 Plackett-Burman实验设计法（P-B）  21-22
    1.8.2 最陡爬坡法（Steepest Ascent）  22
    1.8.3 响应面法（Response Surface Methodology, RSM）  22
  1.9 代谢通量分析介绍  22-24
  1.10 本课题的主要研究内容  24-25
第二章 实验材料与方法  25-37
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 菌种  25
    2.1.2 培养基  25-26
    2.1.3 实验药品与试剂  26-27
    2.1.4 实验主要仪器设备  27
  2.2 实验方法  27-37
    2.2.1 基本培养方法  27-28
    2.2.2 出发菌株生理生化特征研究方法  28
    2.2.3 分析方法  28-32
    2.2.4 紫外线诱变育种  32-34
    2.2.5 培养基以及培养条件的优化  34-36
    2.2.6 代谢通量分析  36-37
第三章 高产D-乳酸菌种的诱变选育  37-65
  3.1 出发菌株的研究  37-38
    3.1.1 出发菌株的形态学研究  37
    3.1.2 出发菌株的发酵曲线  37-38
  3.2 高产菌株的选育  38-48
    3.2.1 诱变剂量的确定  38-39
    3.2.2 筛选剂的选择  39-41
    3.2.3 紫外诱变结果  41-46
    3.2.4 突变株稳定性分析  46-48
  3.3 发酵培养基组分以及培养条件对产D-乳酸能力的影响  48-56
    3.3.1 碳源对产D-乳酸能力的影响  48-49
    3.3.2 氮源对产D-乳酸能力的影响  49-51
    3.3.3 碳酸钙对产D-乳酸能力的影响  51-52
    3.3.4 种龄对产D-乳酸能力的影响  52-53
    3.3.5 接种量对产D-乳酸能力的影响  53-54
    3.3.6 装液量对产D-乳酸能力的影响  54-55
    3.3.7 温度对产D-乳酸能力的影响  55-56
  3.4 发酵培养基组分以及培养条件对产D-乳酸能力的影响  56-65
    3.4.1 Plackett-Burman实验设计法筛选重要因素  56-58
    3.4.2 最陡爬坡实验  58-59
    3.4.3 响应面分析法（RSM）优化发酵培养基和培养条件  59-65
第四章 代谢通量分析  65-74
  4.1 S.inlinus发酵产酸种类的确定  65-66
  4.2 代谢通量模型的建立  66-69
  4.3 S.inlinus的代谢通量分析  69-74
    4.3.1 出发菌株SP-BME126 在发酵不同时期的代谢通量分布  69-71
    4.3.2 突变株SP-MD1 在发酵不同时期的代谢通量分布  71-74
第五章 结论  74-75
参考文献  75-81
致谢  81

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制有机酸 > 乳酸
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