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盐藻多糖合成关键酶—尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（DsUGD）基因分析及耐盐相关性研究

作　者: 贺顺姬
导　师: 乔代蓉
学　校: 四川大学
专　业: 微生物学
关键词: 盐生杜氏藻 尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶 多糖 蛋白质表达 Western blotting
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 173次
引　用: 2次
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内容摘要


已有研究表明多糖可以作为一种渗透调节剂和缓冲剂保护机体免受高盐等胁迫条件对机体造成的危害。盐藻(Dunaliella salina)是一种极端的耐盐生物，但是对于多糖在其耐盐中的作用及机制尚未见相关报道。因此，开展盐藻多糖相关的研究对于认识盐藻耐盐机制具有重要的意义。 尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDP-glucose dehydrogenase，UGD)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)生成尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDP-glucuronic acid)，该产物是多糖合成中的一种最重要的前体物质。本实验室首次从盐藻中克隆得到尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶DsUGD基因，并发现高盐胁迫对DsUGD基因具有明显的诱导作用。在此研究基础上，本研究通过高盐胁迫下盐藻多糖变化以及DsUGD在翻译水平上表达差异等实验，进一步揭示了该基因与盐胁迫之间的关系，并探讨了DsUGD基因在盐藻耐受盐胁迫的早期机制中的作用。本实验的主要内容包括： 1、盐胁迫下盐藻多糖产量的变化趋势 通过对胞内和胞外多糖的提取测定，结果表明胞外多糖在高盐(3.5mol／L)胁迫下产量高于0.5mol／L、1.5mol／L条件下产量，并且多糖产量从1h开始上升，在2h达最大值，此后逐渐降低，8h达到平稳下降趋势；胞内多糖含量在0～8h之间变化不大，但3.5mol／LNaCl胁迫下，盐藻多糖含量明显高于1.5mol／L和0.5mol／LNaCl条件下胞内含量。这表明在外界盐胁迫条件下，盐藻多糖参与到机体抵制胁迫的过程，为进一步研究DsUGD基因在盐藻中的功能打下基础。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-12
第一章 盐藻在不同盐浓度胁迫条件下多糖产量的变化  12-19
  1 材料和方法  12-14
    1.1 材料  12-13
      1.1.1 藻种  12
      1.1.2 仪器  12
      1.1.3 试剂  12
      1.1.4 盐藻培养基  12-13
    1.2 方法  13-14
      1.2.1 盐藻培养  13
      1.2.2 盐藻的胁迫培养  13
      1.2.3 盐藻多糖的提取  13
      1.2.4 盐藻多糖浓度的测定  13
      1.2.5 标准曲线的建立  13-14
  2.结果及分析  14-17
    2.1 盐藻生长状况测定  14
    2.2 多糖测定标准曲线的建立  14-15
    2.3 盐藻总多糖变化趋势  15
    2.4 盐藻胞外多糖变化趋势  15-16
    2.5 盐藻胞内多糖变化趋势  16-17
  3.讨论  17-19
    3.1 苯酚-硫酸法测定多糖浓度的原理及注意要点  17
    3.2 高盐胁迫与盐藻多糖之间的关系  17-19
第二章 盐藻尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(DSUGD)基因序列分析  19-32
  1 分析方法  19-21
    1.1 核苷酸序列分析  19-20
      1.1.1 起始ATG的预测  19
      1.1.2 加A信号位点预测  19
      1.1.3 序列相似性比对  19
      1.1.4 序列ORF(open reading frame finder)读框分析  19-20
    1.2 蛋白质序列分析  20-21
      1.2.1 蛋白质性质分析  20
      1.2.2 DsUGD保守区段的分析  20
      1.2.3 蛋白质序列跨膜结构分析及信号肽预测  20
      1.2.4 高级结构(二级和三级结构)预测  20
      1.2.5 蛋白家族分析  20
      1.2.6 系统发育分析  20-21
  2 结果  21-30
    2.1 核酸序列分析  21-25
      2.1.1 起始ATG的预测  21
      2.1.2 加A信号位点预测  21-22
      2.1.3 序列相似性比对  22-24
      2.1.4 序列开放阅读框(ORF)分析  24-25
    2.2 蛋白质序列分析  25-30
      2.2.1 蛋白质性质分析  25
      2.2.2 DsUGD Conserved domain(CD)的分析  25
      2.2.3 蛋白质序列跨膜结构及信号肽的预测  25-26
      2.2.4 高级结构预测  26-28
      2.2.5 蛋白家族分析  28-29
      2.2.6 进化树的构建  29-30
  3 讨论  30-32
    3.1 生物信息学分析的方法  30
    3.2 DsUGD的结构和功能预测  30-32
第三章 DSUGD原核表达及蛋白纯化  32-57
  1.材料和方法  32-47
    1.1 材料  32-37
      1.1.1 菌种、藻种  32
      1.1.2 载体  32
      1.1.3 酶制剂  32
      1.1.4 试剂盒  32-33
      1.1.5 培养基：  33
      1.1.6 试剂  33-37
      1.1.7 实验仪器设备  37
    1.2 方法  37-44
      1.2.1 盐藻的培养  37
      1.2.2 盐藻总RNA的提取  37-38
      1.2.3 盐藻cDNA的制备  38
      1.2.4 盐藻DsUGD基因的克隆  38-39
      1.2.5 DsUGD测序验证  39-40
      1.2.6 DsUGD大肠杆菌表达载体的构建  40-41
      1.2.7 重组质粒的转化  41-42
      1.2.8 阳性克隆转化子的筛选及验证  42-44
    1.3 重组蛋白的表达  44-45
      1.3.1 融合蛋白的诱导表达  44
      1.3.2 融合蛋白可溶性的鉴定  44-45
      1.3.3 融合蛋白的大量表达  45
    1.4 SDS—PAGE蛋白质凝胶电泳  45-46
      1.4.1 制胶  45
      1.4.2 样品处理及电泳  45-46
    1.5 洗涤包涵体及蛋白纯化  46-47
  2.结果和分析  47-52
    2.1 盐藻总RNA的提取  47
    2.2 原核表达工程菌的构建  47-49
      2.2.1 DsUGD基因的克隆  47-48
      2.2.2 DsUGD表达载体的构建  48-49
    2.3 DsUGD在大肠杆菌中的表达  49-51
      2.3.1 融合蛋白的诱导表达  49-50
      2.3.2 融合蛋白可溶性的鉴定  50-51
    2.4 包涵体的制备及纯化  51-52
  3.讨论  52-57
    3.1 RNA提取中RNase污染的排除  52
    3.2 高保真酶使用注意事项  52-53
    3.3 重组质粒的构建  53
    3.4 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳  53-55
      3.4.1 SDS-PAGE原理  53-54
      3.4.2 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳中的常见问题及解决办法：  54-55
    3.5 表达条件的优化  55-56
      3.5.1 表达载体的选择  55
      3.5.2 诱导条件的优化  55-56
    3.6 融合蛋白纯化  56-57
第四章 DSUGD抗体制备及其在盐胁迫下的表达差异分析  57-67
  1.材料和方法  57-63
    1.1 材料  57-59
      1.1.1 动物  57
      1.1.2 藻种  57
      1.1.3 培养基  57
      1.1.4 试剂  57-59
      1.1.5 实验仪器设备  59
    1.2 方法  59-63
      1.2.1 多克隆抗体的制备  59-61
      1.2.2 盐藻的胁迫培养  61
      1.2.3 盐藻细胞总蛋白的提取  61-62
      1.2.4 盐藻蛋白质含量测定  62
      1.2.5 Western杂交  62-63
  2.结果和分析  63-64
    2.1 抗体效价的检测  63
    2.2 BSA标准曲线的建立  63
    2.3 盐藻总蛋白含量的测定  63
    2.4 SDS—PAGE蛋白质凝胶电泳  63-64
    2.5 Western杂交结果  64
      2.5.1 重组蛋白的Western杂交  64
      2.5.2 高盐处理后盐藻藻体蛋白在表达水平差异  64
  3.讨论  64-67
    3.1 上样量的一致性  64-65
    3.2 盐胁迫对DsUGD表达的影响  65-67
结论  67-68
参考文献  68-71
攻读硕士期间发表的论文  71-73
致谢  73-74
综述  74-96

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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