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果蝇肿瘤抑制基因scrib突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究

作　者: 陈励
导　师: 李明发
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: scrib 极性 细胞增殖 aPKC 磷酸化
分类号: Q963
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


果蝇scrib基因作为nTSGs的一员,在细胞极性与增殖的调控中发挥重要的作用。scrib1是scrib的一种致死突变等位基因。已知其纯合子只能存活到三龄幼虫晚期,并且幼虫的整个生长周期都会延长,成虫盘增大融合,上皮单层细胞结构被破坏,细胞极性丧失。我们动态观察scrib纯合突变幼虫在发育过程中的形态变化,对其幼虫翅成虫盘组织进行细胞计数和免疫荧光染色,观测翅成虫盘整体结构变化和极性丧失,以及细胞形状和数量的改变,以此确定上皮细胞极性丧失与过度增殖在scrib突变体中发生的前后顺序以及可能的内在联系。另外我们在体外克隆表达了scrib截短序列,构建GST融合蛋白后进行了体外激酶试验,希望可以找到aPKC磷酸化位点,以研究Scrib调控上皮极性的可能机制。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一部分 果蝇肿瘤抑制基因scrib 突变体表型的发育动态分析  9-35
  第一章 前言  9-17
    1.1 模式生物－果蝇  9-10
    1.2 癌性肿瘤抑制基因（nTSGs）  10-11
    1.3 scrib 概况  11-12
    1.4 scrib 与细胞极性  12-13
    1.5 scrib 突变与细胞极性  13-14
    1.6 Scrib 负性调控细胞增殖  14-15
    1.7 scrib 突变等位基因  15-17
  第二章 材料与方法  17-22
    2.1 实验材料和实验器材  17-19
    2.2 实验方法  19-22
      2.2.1 观察果蝇幼虫发育时间及生长形态  19
      2.2.2 鬼笔环肽免疫荧光染色  19-20
      2.2.3 细胞计数  20
      2.2.4 Dll 免疫荧光染色  20
      2.2.5 激光共聚焦显微镜图象采集  20-22
  第三章 实验结果  22-32
    3.1 动态观察scrib 纯合突变体果蝇幼虫的生长发育  22-23
    3.2 scrib 突变对果蝇翅成虫盘形态结构的发生及组织生长的影响  23-24
    3.3 动态观察与分析scrib 突变体中翅成虫盘上皮细胞的增殖  24
    3.4 scrib 突变对果蝇翅成虫盘上皮细胞极性和形态结构的影响  24-25
    3.5 scrib 突变改变Wnt 信号通路下游靶基因dll 的表达  25-32
  第四章 讨论  32-35
    4.1 scrib 突变所致两大表型之间的关联  32-33
    4.2 scrib 突变体成虫盘组织细胞过度增殖的原因  33-35
第二部分 果蝇Scrib 蛋白aPKC 磷酸化位点的体外鉴定  35-57
  第一章 背景介绍  35-38
    1.1 aPKC 与细胞极性和增殖  35
    1.2 scrib 与其他nTSGs 间的联系  35-36
    1.3 Lgl 是体内aPKC 磷酸化的底物  36
    1.4 GST 基因融合系统  36-38
  第二章 材料与方法  38-52
    2.1 材料与器材  38-39
    2.2 scrib 全长cDNA 的处理  39
    2.3 感受态细胞的制备  39-40
    2.4 表达质粒的构建  40-45
      2.4.1 引物设计与PCR 扩增目标片断  40-42
      2.4.3 目标片段及载体的酶切与回收定量  42-43
      2.4.4 酶切产物的连接与扩增宿主的转化  43
      2.4.5 重组质粒的扩增与鉴定  43-45
    2.5 GST 融合蛋白的诱导表达与纯化  45-47
      2.5.1 GST 融合蛋白的诱导表达  45
      2.5.2 菌体的裂解破碎  45-46
      2.5.3 GST 融合蛋白的纯化  46-47
    2.6 体外激酶试验  47-48
      2.6.1 体外激酶反应  47-48
      2.6.2 SDS-PAGE 与电转膜  48
      2.6.3 放射自显影  48
    2.7 定点突变  48-52
      2.7.1 使用试剂盒进行定点突变反应  48-50
      2.7.2 使用两次PCR 方法进行定点突变反应  50-52
  第三章 实验结果  52-56
    3.1 Scrib 在体外是aPKC 蛋白激酶的磷酸化底物  52
    3.2 排除4 个可能的磷酸化位点  52-53
    3.3 将范围缩小到可能的2 个磷酸化位点  53-54
    3.4 第四次体外激酶反应试验  54-56
  第四章 讨论  56-57
参考文献  57-61
致 谢  61-62
攻读学位期间发表的学术论文目录  62

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中图分类: > 生物科学 > 昆虫学 > 昆虫遗传学
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