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1.穴居狼蛛毒素lystoxin Ⅱ的结构与功能研究 2.非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术在本实验室的建立

作　者: 代龙军
导　师: 谢锦云；梁宋平
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 穴居狼蛛细胞毒性肽 LystoxinⅡ 爪蟾卵母细胞双电极电压钳
分类号: Q51-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

第一部分穴居狼蛛毒素lystoxinⅡ的结构与功能研究使用羧甲基阳离子交换色谱和反相色谱相结合的方法，从采自新疆的穴居狼蛛（Lycosa singoriensis）的毒液中分离到一个细胞毒性肽，命名为LystoxinⅡ。LystoxinⅡ约占毒液干重的1％。经MMALDI-TOF MS鉴定，LystoxinⅡ的分子量为7335.35Da。LystoxinⅡ由65个氨基酸残基组成，其C端是酰胺化的。通过Edman降解测序测得N端的33个氨基酸残基的序列，并以测得的序列设计引物，采用RACE方法进行cDNA克隆，确定LystoxinⅡ的氨基酸序列为：KECIPKHHECTSNKHGCCRGNFFKYKCQCTTVVTQDGEQTERCFCGTPPHHKAAELVVG FGKKIF-NH2。其cDNA开放阅读框编码107个氨基酸的毒素前体肽，此前体肽包括20个氨基酸残基组成的信号肽序列，21个氨基酸残基组成的Pro区域和65个氨基酸残基组成的成熟肽，还包括一个在发生C端的酰胺化反应后去除的氨基酸残基Gly。lystoxinⅡ是一个碱性多肽，理论值为8.69。生物信息学分析显示，与lystoxinⅡ氨基酸序列相似度最高的两个肽是CSTX-1和CSTX-9，lystoxinⅡ的8个cys均参与分子内二硫键的形成，形成四对二硫键。二硫键的配对方式可能与CSTX-1、CSTX-9一致，按C1-C4；C2-C5；C3-C8；和C6-C7形成二硫键，是一种ICK（抑制剂半胱氨酸结）模体的结构。在50μM的浓度下，LystoxinⅡ可以造成非洲爪蟾卵母细胞漏电流的急剧增大。在100μM的浓度下，LystoxinⅡ可使42％的人红细胞溶解。用MTT法检测，LystoxinⅡ对Hela细胞生长的半有效抑制浓度（）IC₅₀为22.0μmol／L。对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌进行了抗菌实验，结果发现在12.5-50μM浓度范围内LystoxinⅡ对本文所测试的细菌的生长没有明显的抑制作用。第二部分非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术的建立非洲爪蟾的卵母细胞可以高效、忠实地表达外源的基因并能将亚基装配成受体或通道，然后将受体或通道整合到细胞膜上。这些整合在细胞膜上的受体或者通道可以产生可兴奋的电生理反应，从而成为一种有力的分子神经生物学研究手段。现在，已经能在卵母细胞上表达许多离子通道、离子泵和受体，因此，卵母细胞也成为研究编码离子通道、离子泵和受体基因的工具。将从组织中提取的mRNA或者从cDNA体外转录的mRNA显微注射到卵母细胞内，卵母细胞的蛋白质合成系统将mRNA翻译为蛋白质，这些蛋白质合成后被整合到细胞膜上。运用这种方法，人们已经成功地将许多种类的配体门控离子通道和电压门控离子通道在卵母细胞上表达。一旦配体门控离子通道或电压门控离子通道在卵母细胞上表达，就可以用电生理或生物化学的方法来进行研究。这比直接用神经元细胞作为实验材料的难度大大降低了。本实验室建立起卵母细胞．电压钳系统，就可以研究毒素对离子通道的亚型的作用，从而把毒素对离子通道的作用研究推向深入。

全文目录

缩写表  3-5
中文摘要  5-8
Abstract  8-12
第一部分穴居狼蛛毒素lystoxinⅡ的结构与功能研究  12-72
  第一章节肢动物的抗菌肽与细胞毒性肽研究进展  12-36
    1. 前言  12-14
    2. 节肢动物血淋巴中的抗菌肽  14-16
    3. 节肢动物毒液中的抗菌肽与细胞毒性肽  16-30
    4. 来自血淋巴与来自毒液的抗菌肽的相似性与差异  30-31
    5. 为什么毒液中会有细胞毒性肽?  31-34
    6. 结论  34-36
  第二章穴居狼蛛毒素lystoxin Ⅱ的分离、鉴定、cDNA克隆、表达与生物学功能研究  36-72
    1. 前言  36-38
    2. 材料和试剂、仪器  38-39
    3. 方法  39-59
    4. 结果与分析  59-70
    5. 结论  70-71
    6. 进一步研究设想  71-72
第二部分非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术的建立  72-97
  1. 前言  72-75
  2. 材料、试剂与仪器  75-77
  3. 方法  77-83
    3.1 对包含通道基因的质粒进行扩增  77
    3.2 对包含通道基因的质粒进行线性化  77-79
    3.3 体外转录获得信使RNA  79-81
    3.4 获得卵母细胞  81-82
    3.5 将信使RNA显微注射到卵母细胞中  82
    3.6 电压钳记录离子通道电流  82-83
  4. 结果与分析  83-86
    4.1 滤泡膜上的酸敏感离子通道电流  83
    4.2 表达的Kv2.1通道电流  83-86
  5. 讨论  86-97
论文发表  97-98
致谢  98-99

1.穴居狼蛛毒素lystoxin Ⅱ的结构与功能研究 2.非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术在本实验室的建立

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