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pH改变对大鼠P2X_4受体激活电流的调制

作　者: 程剑侠
导　师: 张玉芹
学　校: 武汉科技大学
专　业: 生理学
关键词: cDNA P2X4受体 体外转录 mRNA 微量注射 ATP-激活电流 pH 爪蟾卵母细胞 分布 特性 调制 生物功能
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


第一部分P2X4嘌呤受体异体表达模型的建立目的:将大鼠颈上神经节P2X4受体的cDNA转录成mRNA,在非洲爪蟾卵母细胞中进行表达,记录P2X4受体激活电流。方法:将克隆在pcDNA3载体上的P2X4受体的cDNA用体外转录的方法转录成mRNA,通过显微注射技术将mRNA注射到卵母细胞,在室温孵育48小时～72小时,用双极电压钳技术记录非洲爪蟾卵母细胞表达的受体激活电流。结果:爪蟾卵母细胞可用做P2X4嘌呤受体的异体表达模型,ATP激活的P2X4受体电流呈浓度依赖型,pyridoxal-phosphate-6-azophe-nyl-2’,4’-disulphonic acid （PPADS）和苏拉明嘌呤受体拮抗剂对P2X4受体IATP几乎无作用。结论:非洲爪蟾卵母细胞可作为P2X嘌呤受体的异体表达系统,为进一步研究嘌呤受体的功能和调制提供了有力的工具。第二部分pH改变对大鼠P2X4受体激活电流的调制。目的:探讨表达在非洲爪蟾卵母细胞上大鼠颈上神经节P2X4受体激活电流的特征及pH的调制。方法:将外源性P2X4受体的mRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳技术研究表达在非洲爪蟾卵母细胞上的P2X4受体激活电流。结果:实验检测到表达有P2X4受体的卵母细胞全部对ATP敏感（10-4mol/L）,该电流表现出较慢的去敏感性和浓度依赖性,具有可重复性,ATP饱和浓度为300μM,电流幅度最大达到5μA;细胞外液分别应用pH为7.4、6.3、5.8的ATP（10-4mol/L）后,电流幅值明显降低,在pH7.4、6.3时,P2X4受体激活电流的EC50分别是9.1±0.4μM和11.2±0.4μM（ANOVA,P<0.01,n=6）。结论:pH降低对表达在爪蟾卵母细胞上的大鼠颈上神经节神经元P2X4受体的激活电流具有抑制作用。第三部分P2X4受体研究进展（综述）P2X4受体已从大鼠和人脑多种组织中分离出来,是分布于大脑神经系统中最多的一种亚型。由于它在外周和神经系统的重要作用而受到重视,本文着重介绍P2X4受体的结构,分布,特性和其它物质对它的调制以及生物功能。

全文目录


第一部分 P2X_4嘌呤受体异体表达模型的建立  5-23
  摘要  5-6
  Abstract  6-7
  前言  7-8
  材料和方法  8-17
    1 实验材料  8-10
      1.1 实验试剂  8
      1.2 溶液配制  8-10
      1.3 实验仪器  10
    2 方法  10-17
      2.1 P2X_4 cDNA 表达载体的构建  10-11
      2.2 质粒cDNA 的提取纯化  11-13
        2.2.1 P2X_4cDNA 质粒的洗脱  11
        2.2.2 大肠杆菌（DH5α）的扩增  11
        2.2.3 感受态细胞的制备  11-12
        2.2.4 P2X_4cDNA 转化到感受态大肠杆菌中  12
        2.2.5 P2X_4cDNA 菌落筛选  12
        2.2.6 P2X_4cDNA 质粒提取与纯化  12-13
        2.2.7 检测cDNA 纯度与浓度  13
      2.3 cDNA 的电泳和浓度的计算  13-14
        2.3.1 电泳检测  13-14
      2.4 cDNA 体外转录  14-15
        2.4.1 模板cDNA 线性化  14-15
        2.4.2 cDNA 体外转录  15
        2.4.3 转录反应的终止和mRNA 的纯化  15
      2.5 卵母细胞的准备  15
      2.6 mRNA 的注射及在卵母细胞的表达  15-17
  结果  17-19
    3.1 P2X_4cDNA 纯化质粒和单酶切后的鉴定  17
    3.2 体外转录  17-18
    3.3 P2X_4cDNA 在卵母细胞中表达  18-19
  讨论  19-20
  参考文献  20-23
第二部分 pH 改变对大鼠P2X_4受体激活电流的调制  23-33
  摘要  23-24
  Abstract  24-25
  前言  25
  1 实验材料  25-26
    1.1 实验动物  25
    1.2 实验试剂  25
    1.3 溶液配制  25-26
    1.4 实验仪器  26
  2 实验方法  26-27
    2.1 mRNA 的准备和卵母细胞的表达  26
    2.2 药物和仪器  26-27
    2.3 电生理记录  27
    2.4 数据处理  27
  3 结果  27-31
    3.1 P2X_4 受体激活电流的特征  27-28
    3.2 pH 对ATP 激活电流的调制作用和浓度-效应关系  28-30
    3.3 pH 对ATP 激活电流的电流-电压关系曲线的影响  30-31
  4 讨论  31
  参考文献  31-33
第三部分 P2X_4受体研究进展（综述）  33-44
  摘要  33
  Abstract  33-34
  前言  34
  1 P2X_4 的基因结构  34
  2 P2X_4 受体的蛋白质结构  34-36
  3 P2X_4 的激动剂，拮抗剂，穿透性  36-37
  4 P2X_4 受体类似物的特点：人类，大鼠，小鼠P2X_4 受体  37
  5 IVM 对P2X_4 受体通道的变够调制  37-38
  6 金属，酸，乙醇对P2X_4 受体的调制  38
    6.1 金属对P2X_4 受体的调制  38
    6.2 酸对P2X 受体的调制  38
    6.3 乙醇对P2X_4 受体的调制  38
  7 P2X_4 受体分布  38-39
  8 P2X_4 受体的生物学功能  39-41
  参考文献  41-44
致谢  44-45
详细摘要  45-46

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中图分类: > 生物科学 > 生理学 > 神经生理学
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