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根癌农杆菌介导的Expansin基因转化烟草的研究

作　者: 邓年方
导　师: 王义强
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Expansin基因烟草根癌农杆菌遗传转化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Expansin是近年来发现的迄今惟一能诱导热钝化的离体细胞壁伸展的细胞壁特异性蛋白质。Expansin在控制植物细胞生长方面，能调节细胞壁的膨胀。可以通过生长素调控，引起pH下降，激活相关水解酶，引起木葡聚糖或β-葡聚糖等半纤维素的降解，打断半纤维素与纤维素微纤丝之间的氢键，改变细胞壁的承重网络，从而加速生长。如果将Expansin基因转入杨树、桉树等重要林木，则可以提高林木的生长速率，加速成材，具有很大的应用前景及经济价值。烟草是最早也是最多应用于分子生物学和基因工程研究的模式植物之一。本实验通过农杆菌菌介导法用含有抗卡那霉素的npt 11基因的双元载体将Expansin基因导入到烟草叶外植体中，然后在含有卡那霉素的选择培养基上进行筛选培养，并经过PCR检测，获得了一批烟草转基因植株。其实验结果如下： 1．高效植株再生体系的建立 (1) 芽的诱导经比较确定14-18d苗龄烟草的叶片为再生能力较强的外植体，以MS为基本培养基，从设计的一系列培养基中按效果筛选出MS+6.BA 0.5mg／L为诱导芽分化的培养基，出芽多，叶外植体平均出芽数为8.7个；生长快，7d左右即可诱导出芽来。 (2) 芽的生根以1／2MS培养基为基本培养基，从设计的一系列培养基中按效果筛选出1／2MS+IAA 0.1mg／L为芽的生根培养，生根率达100％，根系发达，呈辐射状。本实验基本上建立了高效烟草植株再生体系，为更多外源目的基因的导入奠定了基础。 2．烟草遗传转化体系的建立 (1)卡那霉素筛选浓度的确定由于所构建的植物表达载体携带有新霉素磷酸转移酶(npt Ⅱ)基因，因此以Kan为筛选试剂选择转化细胞。烟草叶片外植体在Kan 25mg／L的培养基上能正常分化出芽，可保持绿色，与在0mg／L的培养基上无明显差异；

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩略词  13-14
1 绪言  14-26
  1.1 植物基因工程研究进展  14-20
    1.1.1 转基因植物发展概况  14
    1.1.2 植物转化是对植物进行品种改良的有效手段  14-15
    1.1.3 遗传转化方法  15-19
      1.1.3.1 农杆菌介导法  15-17
      1.1.3.2 直接转化法  17-19
    1.1.4 转基因植株的筛选与检测  19-20
      1.1.4.1 转基因植物的筛选  19
      1.1.4.2 转基因植物的检测  19-20
  1.2 Expansin的研究进展  20-25
    1.2.1 Expansin的发现和作用  20-21
    1.2.2 Expansin蛋白分子特征  21-22
    1.2.3 Expansin的作用机理  22
    1.2.4 Expansin与激素的关系  22-24
    1.2.5 Expansin基因的研究状况  24
      1.2.5.1 Expansin基因的克隆与序列分析  24
      1.2.5.2 Expansin的基因家族  24
    1.2.6 转Expansin基因的研究进展  24-25
  1.3 本研究的内容、目的与意义  25-26
2 实验仪器、材料与方法：  26-32
  2.1 仪器设备  26
  2.2 实验材料  26-27
    2.2.1 植物材料  26
    2.2.2 菌株、植物转化载体  26-27
  2.3 主要试剂及药品  27-29
    2.3.1 培养基  27-28
      2.3.1.1 植物培养基  27-28
      2.3.1.2 细菌培养基  28
    2.3.2 常用储存液  28
    2.3.3 主要试剂配方  28
    2.3.4 工具酶及其它分子试剂  28-29
  2.4 实验方法  29-32
    2.4.1 由烟草种子萌发获得无菌苗  29
    2.4.2 烟草高频再生体系的建立  29
      2.4.2.1 愈伤组织或不定芽的诱导  29
      2.4.2.2 诱导生根  29
    2.4.3 外植体卡那霉素敏感性实验  29
    2.4.4 利用农杆菌介导的外植体遗传转化  29-30
      2.4.4.1 菌种活化与菌液制备  29
      2.4.4.2 外植体的预培养  29-30
      2.4.4.3 农杆菌浸染转化及共培养  30
      2.4.4.4 不定芽的诱导与植株再生  30
    2.4.5 转化植株的移栽  30
    2.4.6 转化植株的PCR检测  30-32
      2.4.6.1 植物总DNA的提取  30-31
      2.4.6.2 转化植株基因组的PCR扩增  31-32
3 结果与分析  32-38
  3.1 叶外植体再生体系的建立  32-34
    3.1.1 不同芽诱导培养基对叶外植体分化能力的影响  32
    3.1.2 不同生根培养基对不定根的诱导  32-33
    3.1.3 无菌苗苗龄对外植体再生能力的影响  33-34
  3.2 卡那霉素对叶外植体敏感性的测定  34
  3.3 影响根癌农杆菌转化烟草的因素  34-36
    3.3.1 菌液浓度对转化效率的影响  34-35
    3.3.2 浸染时间对转化效率的影响  35
    3.3.3 共培养时间对转化效率的影响  35-36
    3.3.4 预培养时间对转化效率的影响  36
  3.4 转化植株的生根筛选  36
  3.6 PCR检测的结果  36-37
  3.7 转基因植株的移栽  37-38
4 结论与讨论  38-42
  4.1 结论及创新点  38
  4.2 讨论  38-41
    4.2.1 卡那霉素筛选浓度的确定  38-39
    4.2.2 影响农杆菌介导Expansin基因转化烟草的影响因素  39-40
      4.2.2.1 外植体叶龄  39
      4.2.2.2 侵染时间  39
      4.2.2.3 菌液浓度  39
      4.2.2.4 共培养时间  39-40
      4.2.2.5 预培养时间  40
    4.2.3 PCR检测  40-41
  4.3 有关下一步工作的计划  41-42
参考文献  42-50
附图Ⅰ：  50-51
附图Ⅱ：  51-52
附图Ⅲ：  52-53
附图Ⅳ：  53-54
附图Ⅴ：  54-55
附图Ⅵ：  55-56
致谢  56-57
攻读学位期间的主要学术成果  57

根癌农杆菌介导的Expansin基因转化烟草的研究

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